Degradação de Ocratoxina a: estudo de processo e toxicidade

Abstract

A ocratoxina A (OTA), micotoxina encontrada em diferentes níveis e em diversas matrizes, apresenta efeitos carcinogênicos, nefrotóxicos e teratogênicos. O desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação a níveis permitidos pela legislação é incentivado e os processos biológicos utilizados envolvem o uso de enzimas e/ou microrganismos para degradação da OTA e são preferenciais pela especificidade, bem como pelas condições brandas para a detoxificação. O objetivo do trabalho foi estudar a ação de carboxipeptidase A nos níveis e na toxicidade de OTA, visando aplicar a técnica para detoxificar farinhas de trigo. Primeiramente foi estimado o risco de exposição à ocratoxina A pelo consumo de farinhas de trigo. Para isso foram estabelecidas condições de determinação de OTA em farinhas de trigo, empregando técnicas de estatística multivariada para definir os principais interferentes na extração de OTA pelo método de QuEChERS e detecção em CLAE-FL. O método validado permitiu a avaliação da ocorrência natural em 20 amostras de farinha de trigo, estando estas contaminadas na faixa de 0,22 a 0,85 µg.kg-1 , apresentando um valor de ingestão diária de 0,08 ngOTA.dia-1 .kgmassacorpórea -1 e uma disponibilidade de 94,4%. Em seguida foi realizada a padronização da extração de carboxipeptidase A em biomassa de Rhizopus oryzae que consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40 kHz e a triagem de agentes biológicos para degradação de OTA. Para o estudo da degradação in vitro de OTA, método de extração e detecção de OTA e OTα em CLAEFL foi validado e o processo de degradação foi realizado com Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, obtendo-se uma redução máxima de 63,5% e 57,7%, respectivamente. A degradação apresentou uma correlação alta (R>0,9) e significativa (p<0,05) com a produção de Otα, indicando que ocorreu a produção de enzimas capazes de hidrolisar a micotoxina, por exemplo, a carboxipeptidase A. O estudo da toxicidade de OTA e seu metabólito OTα foi realizado em neutrófilos humanos, onde foi observado a ausência de efeito tóxico de OTα. Também foi determinado o mecanismo de toxicidade de OTA pelo aumento de Ca2+ intracelular pela liberação a partir das reservas internas. Esta liberação, subsequentemente, provoca uma cascata de eventos, nomeadamente: a produção de espécies reativas, depleção de ATP, perda de ΔΨm, levando à morte por necrose. Para reduzir o risco de exposição à micotoxina pela ingestão de matéria prima contaminada, carboxipeptidase A extraída de diferentes fontes foi aplicada na hidrólise de OTA em farinha de trigo para posterior determinação do conteúdo residual de OTA e OTα, empregando método validado. O estudo mostrou uma redução de OTA entre 16,8 e 78,5% e produção de OTα entre 2 a 8,2 ng.g-1 . As carboxipeptidases mais promissoras para degradação foram as provenientes de Rhizopus e Trichoderma e a carboxipeptidase comercial. Ficou demonstrado que se pode recomendar a aplicação de enzimas proteolíticas, tipo carboxipeptidase, para reduzir o risco de exposição à micotoxina quando utilizada matéria prima contaminada, por exemplo, farinha de trigo para diferentes processos. A transformação de OTA para OTα e seus efeitos na redução da toxicidade da micotoxina corroboram com esta afirmação.

Ochratoxin A (OTA), a mycotoxin found in different levels in various matrices, has carcinogenic, nephrotoxic and teratogenic effects. The development of methods to reduce this contamination levels to the one allowed by the legislation is encouraged and biological methods which involve the use of enzymes and/or micro-organisms for OTA degradation are preferred due its specificity as well as the mild conditions for detoxification. The objective was to study the action of carboxypeptidase on OTA levels and toxicity in order to apply the technique to detoxify wheat flours. First we estimated the risk of exposure to ochratoxin A by the consumption of wheat flours. For that conditions to determinate OTA in wheat flours were established, using multivariate statistical techniques to define the main interfering in the extraction of OTA by the QuEChERS method and detection in HPLC-FL. The validated method allowed the evaluation of the naturally occurring on 20 wheat flour samples, these being contaminated in the range of 0.22 to 0.85 µg.kg-1 , with a daily intake of 0.08 ngOTA.day-1 .kgbodyweight -1 and a digestibility of 94.4%. Then standardization of carboxypeptidase A extraction on Rhizopus oryzae biomass was carried out, which consisted of ultrasonic agitation for 30 minutes at 150 W and 40 kHz and the screening of biological agents to OTA degradation were assessed. To study the in vitro degradation of OTA a method for extraction and detection of OTA and OTα in HPLC-FL was validated and the degradation process was performed with Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei, encountering a reduction of 63.5% and 57.7%, respectively. The degradation showed a high (R> 0.9) and significant (p <0.05) correlation with Otα production, indicating that a enzyme capable of hydrolyzing the mycotoxin was produced, for example, carboxypeptidase A. The study of OTA and is metabolite OTα toxicity was performed on human neutrophils, where it was observed the absence of OTα toxic effect. It was also determined OTA toxicity mechanism by the increase in the intracellular Ca2+ release from internal stores. This release subsequently triggers a cascade of events, namely: production of reactive species, ATP depletion, ΔΨm loss, leading to death by necrosis. To reduce the risk of exposure to mycotoxin by eating contaminated ray materials, carboxypeptidase A extracted from different sources was applied to the hydrolysis of OTA on wheat flour for subsequent determination of the residual content of OTA and OTα employing validated method. The study showed an OTA decrease between 16.8% and 78.5 and OTα production from 2 to 8.2 ng.g-1 . The most promising carboxypeptidases for degradation were obtained from Rhizopus and Trichoderma, and the commercial carboxypeptidase. It was shown that it may be recommend the use of proteolytic enzymes, type carboxypeptidase, to reduce the risk of exposure to mycotoxin when contaminated raw material is used, for example, wheat flour for different processes. The transformation of OTA to OTα and its effect in reducing the mycotoxin toxicity corroborate with this statement.

Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma abordagem inovadora para avaliar os efeitos da composição de cereais na extração de ocratoxina A por análise multivariada e aplicar o método validado para estimativa de risco de exposição à ocratoxina A pelo consumo de farinhas de trigo. A análise de componentes principais (ACP) foi aplicada para comprovar o efeito de componentes majoritários da matriz na recuperação de ocratoxina A pelo método QuEChERS em CCD e CLAE e para validar o método para determinação de ocratoxina A em farinhas por CLAE. As matrizes utilizadas, farelo de arroz, de trigo e farinha de trigo foram caracterizadas físico-quimicamente. A recuperação de OTA nessas matrizes foi altamente influenciada (R=0,99) pelo conteúdo de açúcares presente nas matrizes, tendo como menor interferente o conteúdo lipídico (R=0,29). A partir desses resultados, o método QuEChERS foi padronizado para extração de OTA utilizando ACN 1%:água (7:3) como solvente extrator e como sais, sulfato de magnésio seco e cloreto de sódio. Os valores de recuperação variaram de 97,6 a 105%. O método validado permitiu a avaliação da ocorrência natural de 20 amostras de farinha de trigo, estando estas contaminadas na faixa de 0,22 a 0,85 µg.kg-1 , apresentando um valor de ingestão diária de 0,08 ngOTA.dia-1 .kgmassacorpórea -1 e uma disponibilização de 94,4%.

Micotoxinas são produzidas por fungos filamentosos em diferentes etapas da cadeia produtiva de alimentos, destacando-se a ocratoxina A (OTA) por seus efeitos nefrotóxicos, carcinogênicos e teratogênicos. O desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação a níveis permitidos pela legislação são incentivados e os processos biológicos, envolvendo o uso de enzimas e microrganismos para degradação da OTA são preferenciais pela especificidade e condições brandas de detoxificação. Neste trabalho, foram estabelecidas condições de extração de carboxipeptidase A a partir de biomassa fermentada por Rhizopus oryzae para empregá-la na degradação de OTA, tendo a pancreatina como controle. O método padronizado para extração enzimática consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40 kHz. O extrato enzimático do microrganismo degradou 19,4% sendo 49% superior quando comparado com a pancreatina. Ficou demonstrada a vantagem da utilização de enzimas microbianas para processos de degradação de micotoxinas.