Caracterização dos efeitos da genisteína em membranas de asolecitina de soja: correlação com atividades biológicas

Abstract

Neste estudo, realizou-se a incorporação e caracterização dos efeitos da isoflavona genisteína (Gn) na dinâmica molecular de lipossomos de asolecitina de soja (ASO), por meio de UV-vis, HATR- FTIR, RMN, DSC, potencial zeta e DLS. Os resultados obtidos neste contexto foram correlacionados com dados de atividade da Gn frente à peroxidação in vitro induzida por radical hidroxil e testes de viabilidade celular em linhagens celulares de glioma de rato e adenocarcinoma da mama humano, através do ensaio MTT. A concentração de saturação de Gn incorporada em lipossomos de ASO foi detectada em 484 µM (0,13 mg/mL). Nesta concentração, a Gn inibiu a peroxidação lipídica em 90,90%. Os lipossomos contendo genisteína em uma concentração de 20 µM reduziram a viabilidade celular das linhagens de glioma C6 e carcinoma MCF-7 em 25%. Resultados referentes aos ensaios de caracterização indicaram que a genisteína influenciou a dinâmica de diferentes regiões da membrana composta por ASO. Os resultados HATR - FTIR demonstraram que a isoflavona aumentou em 1,93 cm-1 a freqüência da banda referente ao estiramento assimétrico do grupo fosfato (ѵas PO2 - ), presente na região polar lipídica, reduzindo o seu grau de hidratação. A Gn também reduziu a largura das bandas de ѵas PO2 - em 2,74 cm-1 . Os resultados de 31P RMN demonstraram que a Gn aumentou a anisotropia de deslocamento químico do grupo fosfato, indicando, junto aos dados obtidos por FTIR, um ordenamento desta região do lipídio. Estudos de RMN indicaram que a genisteína reduziu o valor do tempo de relaxação longitudinal (T1) de 1H da colina lipídica em 0,11 s, demonstrando que a isoflavona aumentou a mobilidade deste grupo polar. Os estudos de cargas na membrana indicaram que a Gn tornou os valores de potencial zeta dos lipossomos, 15 mais positivos, sugerindo que a isoflavona orienta o grupo colina para um plano superior ao plano do grupo fosfato. Na região de interface da membrana, a Gn reduziu a largura de banda de FTIR referente ao estiramento axial do grupo carbonila (ѵ C=O) em 2,9 cm-1 , ordenando esta região. A Gn reduziu o valor de freqüência da banda referente ao estiramento simétrico dos grupos metilenicos presentes na região acil do lipídio (ѵs CH2) em 1,33 cm-1 . Isto indicou um ordenamento da região hidrofóbica da membrana provocado pela isoflavona. Nesta região, foi observado um aumento em 0,46 s no valor de T1 do lipídio após incorporação de Gn. Os resultados de DSC demonstraram um aumento no valor de variação de entalpia (∆H) das cadeias acil de ASO em 0,09 J/g, induzido por Gn. Tais dados de RMN e DSC indicaram um efeito de ordenamento na região hidrofóbica do lipídio. Estes dados foram confirmados por medidas de turbidez, as quais demonstraram que a isoflavona aumentou o valor de densidade ótica do lipídio em 34,6%. Os resultados obtidos neste trabalho contribuirão com dados e informações referentes à interação de Gn e lipossomos de ASO, importantes para a compreensão de seu mecanismo de ação, bem como para o desenvolvimento de sistemas farmacológicos antioxidantes e antitumorais eficientes e menos tóxicos.

In this study, the isoflavone genistein (Gn) was incorporated into soy asolectin liposomes (ASO) and its effects on the membrane molecular dynamics were monitored by UV-vis, HATR-FTIR, NMR, DSC, zeta potential and DLS techniques. These results were then correlated with the Gn activity against the lipid peroxidation induced by hydroxyl radical, as well as with its antitumoral responses in rat glioma and human breast adenocarcinoma cell lines. The Gn saturation concentration on ASO liposomes was detected in 484 µM (0.13 mg/mL). This concentration was sufficient to inhibit the lipid peroxidation in 90.90%. ASO liposomes-loaded genistein at 20 μM decreased C6 glioma and MCF-7 cell viability by 25%. HATR-FTIR results showed that Gn promotes an increase of 1.93 cm-1 in the frequency value related to the asymmetric stretching of lipid phosphate group (ѵas PO2 - ). This suggests that Gn induced a reduction on the hydration degree of this lipid polar region. The Gn also reduced the bandwidth related to ѵasPO2 - in 2.74 cm-1 . 31P NMR spectra indicated that Gn enhances the chemical shift anisotropy of the ASO phosphate group. The FTIR and NMR results showed a Gninduced ordering effect in the lipid phosphate region. 1H NMR spin-lattice relaxation time (T1) measurements showed that Gn reduced the lipid choline T1 value in 0.11 s, which indicate an increase in the mobility of this lipid polar group. The Gn reduced the lipid carbonyl vibrational mode (ѵ C=O) bandwidth in 2.9 cm-1 . This suggested that Gn also orders the interfacial region of the lipid. The isoflavone shifted the FTIR frequency related to the symmetric stretching band of lipid acyl methylenes (ѵs CH2) in 1.33 cm-1 to lower values. Also, Gn promoted an enhancement of 0.46 s in the acyl chainmethylenes NMR T1 value. The DSC results showed a Gn-induced increase on the 17 lipidic enthalpy variation value (∆H) of 0.09 J / g. These results confirmed an ordering effect induced by Gn in the membrane hydrophobic region. This effect was also supported by UV-vis. turbidity analysis, since 484 µM of Gn was sufficient to increase the optical density in 34.6%. Results obtained in this work will contribute with the elucidation of Gn antioxidant and antitumoral mechanism of action as well as to the development of more efficient and less toxic systems to be used in cancer therapy.