Modelos in vivo e in vitro geneticamente modificados como biomarcadores de poluição aquática

Abstract

A indução de vários genes que codificam para enzimas envolvidas no processo de detoxificação celular e resposta antioxidante é mediada através de um mecanismo comum, o qual depende da presença dos elementos de resposta eletrofílicos (EpRE) na região promotora destes genes. No presente estudo foi analisada a homologia da seqüência central do EpRE, a qual representa um sítio de ligação para o fator de transcrição Nrf2, de regiões conservadas de promotores das enzimas glutationa S-transferase (Gsta1), subunidade catalítica da glutamato cisteína ligase (Gclc) e proteína de choque térmico (Hsp70) de zebrafish (Danio rerio) e camundongo (Mus musculus). A seqüência EpRE foi identificada para ambas as espécies em todos os genes comparados, mostrando uma alta similaridade com a seqüência central do EpRE. Adicionalmente, foi produzido um modelo de zebrafish transgênico carregando um transgene que contém um EpRE obtido do promotor da Gsta1 de camundongo fusionado ao promotor mínimo da metalotioneína (mt1) do camundongo direcionando a expressão do gene repórter da luciferase (luc). Este modelo in vivo foi exposto ao sulfato de cobre e o gene repórter foi significativamente ativado. Os genes gclc e hsp70 do zebrafish foram analisados nos peixes transgênicos carregando a construção EpRE-Luc e mostraram um padrão similar de expressão com o gene da luciferase. Também foi produzido um modelo alternativo carregando o transgene EpRE-GFP. Nesta construção genética o gene repórter da luc foi substituído pelo gene da proteína verde fluorescente (gfp). Os peixes carregando o transgene EpRE-GFP foram expostos ao cobre e a expressão da Gfp foi diretamente quantificada nas larvas vivas em fluorímetro. Neste caso, um aumento na expressão da Gfp só foi detectado na maior concentração de cobre, provavelmente, devido ao efeito do mosaismo ou da fluorescência basal das larvas. Na última etapa deste trabalho, foi produzida uma linhagem estável de hepatoma (HTC) carregando o transgene EpRE-GFP. A linhagem EpRE-GFP HTC foi tratada com sulfato de cobre e metil paration por 48 h. Para avaliar as respostas genéticas produzidas por estes poluentes, a expressão da Gfp foi diretamente quantificada e os resultados mostraram que a expressão da Gfp é significativamente aumentada somente nas maiores concentrações de ambos os poluentes. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo demonstram que o uso de EpRE associado a genes repórteres pode ser um modelo interessante para estudo de respostas genéticas das células frente a poluentes aquáticos, bem como uma ferramenta adequada para estudos toxicológicos in vivo e in vitro.