Otimização da produção biotecnológica de lipases e correlação com a produção de biossurfactantes

Abstract

As lipases e os biossurfactantes são compostos produzidos por microrganismos através de fermentações em estado sólido (FES) ou sumberso (FSm), os quais são aplicáveis nas indústrias alimentícia e farmacêutica, na bioenergia e na biorremediação, entre outras. O objetivo geral deste trabalho foi otimizar a produção de lipases através de fermentação em estado sólido e fermentação submersa. Os fungos foram selecionados quanto à habilidade de produção de lipases através de FES e FSm e aqueles que apresentaram as maiores atividades lipolíticas foram utilizados na seleção de variáveis significativas e na otimização da produção de lipases nos dois modos de cultivo. Foram empregadas técnicas seqüenciais de planejamento experimental, incluindo planejamentos fracionários, completos e a metodologia de superfície de resposta para a otimização da produção de lipases. As variáveis estudadas na FES foram o pH, o tipo de farelo como fonte de carbono, a fonte de nitrogênio, o indutor, a concentração da fonte de nitrogênio, a concentração do indutor e a cepa do fungo. Na FSm, além das variáveis estudadas na FES, estudaram-se as variáveis concentração inicial de inóculo e agitação. As enzimas produzidas foram caracterizadas quanto à temperatura e pH ótimos e quanto à estabilidade a temperatura e pH. Nas condições otimizadas de produção de lipases, foi avaliada a correlação entre a produção de lipases e bioemulsificantes. Inicialmente foram isolados 28 fungos. Os fungos Aspergillus O- 4 e Aspergillus E-6 foram selecionados como bons produtores de lipases no processo de fermentação em estado sólido e os fungos Penicillium E-3, Trichoderma E-19 e Aspergillus O-8 como bons produtores de lipases através da fermentação submersa. As condições otimizadas para a produção de lipases através de fermentação em estado sólido foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-4, farelo de soja, 2% de nitrato de sódio, 2% de azeite de oliva e pHs inferiores a 5, obtendo-se atividades lipolíticas máximas de 57 U. As condições otimizadas para a produção de lipases na fermentação submersa foram obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-8, farelo de trigo, 4,5% de extrato de levedura, 2% de óleo de soja e pH 7,15. A máxima atividade obtida durante a etapa de otimização foi 6 U. As lipases obtidas por FES apresentaram atividades máximas a 35ºC e pH 6,0, enquanto que as obtidas por FSm apresentaram ótimos a 37ºC e pH 7,2. A estabilidade térmica das lipases produzidas via FSm foi superior a das lipases obtidas via FES, com atividades residuais de 72% e 26,8% após 1h de exposição a 90ºC e 60ºC, respectivamente. As lipases obtidas via FES foram mais estáveis em pH´s alcalinos, com atividades residuais superiores a 60% após 24 h de exposição, enquanto as lipases produzidas via FSm foram mais estáveis em pH´s ácidos, com 80% de atividade residual na faixa de pH entre 3,5 e 6,5. Na fermentação submersa a correlação entre a produção de lipases e a atividade emulsificante óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O) dos extratos foi 95,4% e 86,8%, respectivamente, obtendo-se atividades emulsificantes máximas O/A e A/O de 2,95 UE e 42,7 UE. Embora a maior produção de lipases tenha sido obtida na fermentação em estado sólido, não houve produção concomitante de biossurfactantes. Os extratos da fermentação submersa apresentaram redução da tensão superficial de 50 mN m -1 para 28 mN m -1 e atividade antimicrobiana frente ao microrganismo S. aureus ATCC 25923, com potenciais antimicrobianos de 36 a 43% nos três primeiros dias de fermentação. A fermentação submersa foi a técnica que apresentou os melhores resultados de otimização da produção de lipases, bem como de produção simultânea de biossurfactantes.

Lipases and biosurfactantes are compounds produced by microrganisms by solid state (SSF) and submerged fermentations (SmF), being applied in food and pharmaceutical industries, in bioenergy and bioremediation, between others. The aim of this thesis was to optimize the production of lipases through solid state and submerged fermentations. The filamentous fungi were selected by the ability of production of lipases in solid-state and submerged fermentations and those that presented the highest lipolitic activities were used in the screening of significant variables and optimization of the lipases production in the both culture modes. The screening of variables and the optimization of lipase production were accomplished using sequential techniques of experimental design, including fractionary and complete designs and the response surface methodology. In solid state fermentation, the variables pH, bran, nitrogen source, inductor, concentration of the nitrogen source and inductor, and fungi were studied. In submerged fermentation beyond the variables studied in SSF, it were studied the initial inoculum concentration and agitation. The enzymes produced in the optimized conditions were characterized about its optimal temperature and pH and about its stability in front of temperature and pH. In the optimized conditions of lipase production, the correlation between lipases and bioemulsifiers production was verified. A total of 28 fungi were isolated, being selected as good producers of lipases in solid state fermentation the fungi Aspergillus O-4 and Aspergillus E-6, and as good producers of lipases in submerged fermentation the strains Penicillium E-3, Trichoderma E-19 and Aspergillus O- 8. In solid state fermentation, optimized conditions of lipase production were obtained using the fungi Aspergillus O-4, soy bran, 2% of sodium nitrate, 2% of olive oil and pHs varying of 3.5 to 4.5, being obtained maximal lipolitic activities of 57 U. The optimized conditions in submerged bioprocess were obtained using the fungi Aspergillus (O-8), wheat bran, 4.5% of yeast extract, 2% of soy oil and pH 7.15, being the maximal activities of 6 U. The optimal activities of lipases produced in solid-state bioprocess were obtained in pH 6.0 and temperature of 35°C and for the lipases produced in submerged fermentation at 37ºC and pH 7.2. Lipases produced by SmF were more stable than those produced by FES, with residual activities of 72% and 26.8% after one hour of exposition at 90ºC and 60ºC, respectively. Lipases obtained by FES presented higher stability in alcaline pH´s, with residual activities of 60% after 24 h of exposition, while lipases obtained in SmF were more stable in acid pH´s, with 80% of residual activities in pH´s between 3.5 and 6.5. Lipases obtained in submerged bioprocess presented maximum activities at 37ºC and pH 7.2, freezing stability at -20ºC during 90 days, 80% of stability in pH of 3.5 to 6.5 and 50% of stability in pH of 7 to 10. With respect of temperature stability, the lipases maintained 72% of residual activity intemperatures of 70 to 90ºC, being these good characteristics to industrial applications. In the submerged bioprocess the correlation of lipase production and the oil/water and water/oil emulsifier activity of the extracts were 95.4 and 86.8%, respectively, obtaining maximal emulsifier activities oil/water and water/oil of 2.95 UE and 42.7 UE. In the solid-state bioprocess, besides the best productivities of lipase production were obtained, no production of biosurfactants was observed. The extracts of submerged fermentation presented reduction of superficial tension of 50 to 28 mN m -1 and antimicrobial activity against the S. aureus ATCC 25923, with antimicrobial potentials of 36 to 43% until the third days of bioprocess. The submerged bioprocess presented the best results in the optimization of lipases production, as well as in the simultaneous production of biosurfactants. Lipases and biosurfactants produced can be applied in food and pharmaceutical industries or in cases of bioremediation.