Purificação, modelagem e simulação da adsorção de bioprodutos por troca iônica em coluna de leito expandido

Abstract

A produção de proteínas através de microrganismos tornou-se uma técnica muito importante na obtenção de compostos de interesse da indústria farmacêutica e alimentícia. Extratos brutos nos quais as proteínas são obtidas são geralmente complexos, contendo sólidos e células em suspensão. Usualmente, para uso industrial destes compostos, é necessário obtê-los puros, para garantir a sua atuação sem interferência. Um método que vem recebendo destaque especialmente nos últimos 10 anos é o uso da cromatografia de troca iônica em leito expandido, que combina em uma única etapa os passos de clarificação, concentração e purificação da molécula alvo, reduzindo assim o tempo de operação e também os custos com equipamentos para realização de cada etapa em separado. Combinado a este fato, a última década também é marcada por trabalhos que tratam da modelagem matemática do processo de adsorção de proteínas em resinas. Está técnica, além de fornecer informações importantes sobre o processo de adsorção, também é de grande valia na otimização da etapa de adsorção, uma vez que permite que simulações sejam feitas, sem a necessidade de gasto de tempo e material com experimentos em bancada, especialmente se é desejado uma ampliação de escala. Dessa forma, o objetivo desta tese foi realizar a modelagem e simulação do processo de adsorção de bioprodutos em um caldo bruto na presença de células, usando inulinase e C-ficocianina como objeto de estudo e purificar C-ficocianina utilizando resina de troca iônica em leito expandido. A presente tese foi então dividida em quatro artigos. O primeiro artigo teve como objeto de estudo a enzima inulinase, e a otimização da etapa de adsorção desta enzima em resina de troca iônica Streamline SP, em leito expandido, foi feita através da modelagem matemática e simulação das curvas de ruptura em três diferentes graus de expansão (GE). As máximas eficiências foram observadas quando utilizadas maiores concentrações de inulinase (120 a 170 U/mL), e altura de leito entre 20 e 30 cm. O grau de expansão de 3,0 vezes foi considerado o melhor, uma vez que a produtividade foi consideravelmente superior. O segundo artigo apresenta o estudo das condições de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica, onde foi verificado o efeito do pH e temperatura na adsorção e após construída a isoterma de adsorção. A isoterma de adsorção da C-ficocianina em resina Streamline Q XL feita em pH 7,5 e a 25°C (ambiente), apresentou um bom ajuste ao modelo de Langmuir (R=0,98) e os valores qm (capacidade máxima de adsorção) e Kd (constante de equilíbrio) estimados pela equação linearizada da isoterma, foram de 26,7 mg/mL e 0,067mg/mL. O terceiro artigo aborda a modelagem do processo de adsorção de extrato não clarificado de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline Q XL em coluna de leito expandido. Três curvas de ruptura foram feitas em diferentes graus de expansão (2,0, 2,5 e 3,0). A condição de adsorção de extrato bruto não clarificado de C-ficocianina que se mostrou mais vantajosa, por apresentar maior capacidade de adsorção, é quando se alimenta o extrato até atingir 10% de saturação da resina, em grau de expansão 2,0, com uma altura inicial de leito de 30 cm. O último artigo originado nesta tese foi sobre a purificação de C-ficocianina através da cromatografia de troca iônica em leito expandido. Uma vez que a adsorção já havia sido estudada no artigo 2, o artigo 4 enfoca na otimização das condições de eluição, visando obter um produto com máxima pureza e recuperação. A pureza é dada pela razão entre a absorbância a 620 nm pela absorbância a 280 nm, e dizse que quando C-ficocianina apresenta pureza superior a 0,7 ela pode ser usada em como corante em alimentos. A avaliação das curvas de contorno indicou que a faixa de trabalho deve ser em pH ao redor de 6,5 e volumes de eluição próximos a 150 mL. Tais condições combinadas a uma etapa de pré-eluição com 0,1M de NaCl, permitiu obter C-ficocianina com pureza de 2,9, concentração 3 mg/mL, e recuperação ao redor de 70%.

The production of proteins using microorganisms has become a very important technique to obtain compounds of interest to the pharmaceutical and food industries. Crude extracts in which proteins are obtained are often complex, containing solids and cells in suspension. Usually, for the industrial use of these compounds it is necessary to obtain them clean, to guarantee their actuation without interference. The use of ion exchange chromatography in expanded bed is a method that has received attention especially in the last 10 years, this method is able to combine in a single step, the clarification, concentration and purification of the target molecule, thus reducing operating time and also equipment costs to perform each step separately. Combined with this fact, the last decade has also been marked by works that deal with the mathematical modeling of the process of adsorption of proteins on resins. This technique in addition to providing important information on the adsorption process, is also of great value in optimizing the adsorption step, since it allows simulations to be made, without spending time and material experiments in a bench, especially if a scale up is desired. In this context, the main objective of this thesis was to perform the modeling and simulation of adsorption of bioproducts in a crude extract in the presence of cells, using inulinase and C-phycocyanin as object of study and purify C-phycocyanin using ionexchange resin in expanded bed. The first article has as object of study the inulinase enzyme, and the optimization of the adsorption step of this enzyme into ion-exchange resin Streamline SP, in expanded bed made by mathematical modeling and simulation of the breakthrough curves. The highest efficiencies were observed when higher inulinase concentrations (120 to 170 U/mL) were used, and height of bed between 20 and 30 cm. The expansion degree (ED) of 3.0 was considered the best, since the yield was considerably the highest. The second article presents a study of the adsorption conditions of C-phycocyanin into ion-exchange resin, where the effect of pH and temperature on the adsorption were verified. The adsorption isotherm of C-phycocyanin on Streamline Q XL resin made at pH 7.5 and 25°C, showed a good fit to the Langmuir model (R=0.98) and values qm (maximum adsorption capacity) and Kd (equilibrium constant) estimated by the linear isotherm equation, were 26.7 mg/mL and 0.067 mg/mL, respectively. The third article discusses the modeling of the adsorption process of unclarified extract of C-phycocyanin into ion-exchange resin Streamline Q XL column in expanded bed. Three breakthrough curves was carried out in different expansion degrees (2.0, 2.5 and 3 0). The adsorption condition of non clarified crude extract of C-phycocyanin which showed more advantageous, presenting an adsorption capacity highest, is when we load the extract to reach 10% of the resin saturation in expansion degree of 2.0, with an initial height of bed of 30 cm. The last article is focused on the purification of C-phycocyanin by ion exchange chromatography in expanded bed. Since the adsorption had already been studied in Article 2, Article 4 focuses on the optimization of elution conditions in order to obtain a product with maximum purity and recovery. The evaluation of the contour plots indicated that the working range should be at pH around 6.5 and elution volumes close to 150 mL. These conditions combined with a preelution with 0.1 M NaCl step, allowed to obtain C-phycocyanin with a purity of 2.9, concentration 3 mg/mL, and recovery around 70%.