Células de anêmonas Bunodosoma cangicum expostas ao cobre: citotoxidade, defesa e dano de DNA

Abstract

Anêmonas-do-mar são pólipos solitários, bentônicos, de pouca mobilidade, que habitam regiões entre-marés. Devido a estas características, são organismos que podem ser atingidos diretamente pela poluição aquática, no entanto, são pouco utilizados como modelo ecotoxicológico. O cobre é um metal essencial, que em altas concentrações pode ser tóxico, sendo bastante comum em ecossistemas marinhos. Um dos mecanismos de toxicidade do cobre envolve a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), podendo levar as células ao estresse oxidativo, que tem como característica danos celulares, inclusive no DNA. Muitos organismos possuem um mecanismo que bombeia os xenobióticos para fora da célula – multixenobiotic resistance (MXR) – que visa prevenir as células dos danos tóxicos causados pelo contaminante. Com isso, o presente trabalho estudou a capacidade de defesa e dano ao DNA à toxicidade causada pelo cobre em células de anêmonas Bunodosoma cangicum. Para isto, células de anêmonas, mantidas em cultura primária através de explante do disco podal, foram expostas ao cobre a duas concentrações (7,8 µg.L-1 Cu e 15,6 µg.L-1 Cu), além do grupo controle, por 6 e 24 h. Antes e após as exposições as células tiveram sua viabilidade avaliada através do método de exclusão por azul de tripan (0,08%) para analisar a citotoxicidade. Parâmetros como a indução do mecanismo MXR através do método de acúmulo de rodamina-B, espécies reativas de oxigênio e ensaio cometa, também foram avaliados. Os resultados obtidos mostram que o cobre é citotóxico, sendo constatada uma queda na viabilidade e no número de células, principalmente após 24 h de exposição, sendo que na concentração de cobre de 15,6 µg.L-1 , foi possível observar uma diminuição de 40% na viabilidade e uma redução em 36% no número de células (p < 0,05, n = 6). Em relação ao fenótipo MXR, foi observada uma ativação do mecanismo apenas naquelas células expostas ao cobre 7,8 µg.L-1 (53%) no tempo de 24 h (p < 0,05, n = 5). Na análise da geração de ERO foi observado um aumento de 11,5% naquelas células expostas por 6 h na concentração mais alta de cobre 15,6 µg.L-1 . Nas células que foram expostas por 24 h, o aumento de espécies reativas pode ser percebido já na concentração de 7,8 µg.L-1 , elevando-se para cerca de 20% quando exposto a 15,6 µg.L-1 (p < 0,05, n = 4-5). Quanto ao dano de DNA, foram vistas quebras na molécula desde 7,8 µg.L-1 Cu em 6 h, com danos ainda mais salientes naquelas células expostas por 24 h, na concentração de 7,8 µg.L -1 Cu (p < 0,05, n = 3-4), e para 15,6 µg.L-1 Cu a viabilidade celular (número de células) não permitiu a análise. Com base nestes dados, pode-se dizer que o cobre, mesmo em baixas concentrações causa estresse em células de B. cangicum, sendo citotóxico. Este metal causa estresse oxidativo com dano à molécula de DNA mesmo com a ativação do mecanismo de defesa.

Sea-anemones are solitary polyps, benthic, of low mobility, inhabiting intertidal regions. Due to these characteristics, they are organisms that can be directly affected by water pollution, however, are infrequently used as ecotoxicological models. Copper is an essential metal, which in high concentrations can be toxic, being quite common in marine ecosystems. One of the mechanisms of copper toxicity involves the production of reactive oxygen species (ROS), leading cells to oxidative stress. This stress can cause cell damage, including to DNA. Many organisms have a mechanism that pumps the xenobiotics out of the cell - multixenobiotic resistance (MXR) – which aims to prevent the cells from damage caused by toxic contaminant. So, the present work studied the ability of defense and DNA damage caused by copper toxicity in cells of Bunodosoma cangicum anemones. For this, exposure of anemones cells were held, kept in primary culture through pedal disk explant, to copper in two concentrations (7.8 µg L-1 Cu and 15.6 µg L-1 Cu), in addition to the control group, for 6 and 24 hours. Before and after exposure the cells had their viability assessed through the exclusion method by Tripan blue (0.08%) to analyze the cytotoxicity. Were also evaluated the induction of MXR mechanism through the method of rhodamine-B accumulation, reactive oxygen species and comet assay to assess the possible damage to the DNA molecule. The results obtained show that copper is cytotoxic, being observed a drop in viability and number of cells, especially after 24 hours of exposure, noticing that in copper concentration of 15.6 µg L-1 , it was possible to observe a 40% decrease in viability and a 36% reduction in the number of cells (p < 0.05, n = 6). In relation to the MXR phenotype, it was observed an activation of the mechanism only in those cells exposed to copper 7.8 µg L-1 (53%) for 24 hours (p < 0.05, n = 5). In the analysis of the generation of ROS it was observed an increase of 11.5% in those cells exposed for 6 hours in the highest concentration of copper 15.6 µg L-1 . In cells that have been exposed for 24 hours, the reactive species increase can be noticed already in the concentration of 7.8 µg L-1 , increasing to about 20% when exposed to 15.6 µg L-1 (p < 0.05, n = 4-5). As for the DNA damage, molecule breaks from 7.8 µg L-1 Cu for 6 hours were seen, with even more salient damage in those cells exposed for 24 hours, at a concentration of 7.8 µg L-1 Cu (p < 0.05, n = 3-4), and to 15.6 µg L-1 Cu the cell number was not enough for analysis. Based on these data, it can be said that copper, even at low concentrations cause stress in Bunodosoma cangicum cells, being cytotoxic. This metal activates cellular defense mechanisms, however, this defense seems to be time and concentration dependent, leading cell to an oxidative stress with subsequent damage to the DNA molecule.

Sea anemones are benthic organisms, of low mobility and can be directly affected by water pollution. This work studied the defense mechanisms and DNA damage caused by copper toxicity in cells from the anemone Bunodosoma cangicum. For this, exposure of anemones cells were held, kept in primary culture through explant of podal disk to copper (7.8 and 15.6 µg L-1 ), and the control group, for 6 and 24h. Cytotoxicity was seen through the viability and cell number, MXR phenotype through the accumulation of Rhodamine-B, ROS generation by H2DCF-DA and DNA damage by comet assay. The results obtained show that there is a drop in viability and number of cells, especially after exposure of 24h in 15.6 µg L-1 . There is an induction of the MXR activity only at 7.8 µg L-1 for 24h. As for ROS, there is an increase in the generation of reactive species in greatest concentration of copper for 6h, and in both for 24h, which leads to oxidative stress, which culminates with a DNA damage. What was evidenced by the increase of the tail size, % DNA presented and moment of tail. Therefore, the copper represents an adversity to the anemones cells, being cytotoxic and genotoxic