Evaluation of direct microplate nitrate reductase assay as a rapid method for the detection of multiple and extensively tuberculosis drug resistance

Abstract

Introduction: Reports of Mycobacterium tuberculosis resistant to multiple drugs are increasing globally and laboratories are becoming increasingly aware of the need for drug susceptibility testing. In recent years, due to the long time required by conventional drug susceptibility testing, new approaches have been proposed for faster detection of drug resistance, such as the nitrate reductase assay, considered fast and inexpensive, making it a good diagnostic tool for low resource countries. Objective: The present study proposed a fast direct colorimetric drug susceptibility testing method in a microplate format using solid medium. Materials and methods: The diagnostic accuracy was evaluated by comparing the proportion method with the direct nitrate reductase assay in plates. Frozen sputum samples, known to be positive, were decontaminated and processed by Petroff method. The decontaminated suspension was used to perform direct nitrate reductase assay in 7H11 medium using 1 µg/ml rifampicin (RIF), 0.2 µg/ml isoniazid (INH), 2 µg/ml ofloxacin (OFX), 6 µg/ml kanamycin (KAN), 2 µg/ml amikacin (AMK) and 10 µg/ ml capreomycin (CAP). Eighty-four samples were tested and the results for 69% of them were available within 21 days. Results: The sensitivity and specificity compared to the proportion method, was 98.5% and 100% for INH, 98.3% and 96.2% for RIF, 91.7% and 100% for KAN, 78.8% and 97.3% for OFX, 100% and 100% for AMK and CAP, respectively. Conclusion: The results lead to the conclusion that direct nitrate reductase assay, in this new format, is an accurate, quick and inexpensive method to determine the susceptibility profile of M. tuberculosis and may become an alternative for countries with limited resources.

Introducción. Los informes sobre Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiples fármacos están aumentando a nivel mundial y los laboratorios toman cada vez más conciencia sobre la necesidad de realizar pruebas de sensibilidad a fármacos. Debido al tiempo prolongado que se requiere para hacerlas, se han propuesto nuevos enfoques para la detección rápida de resistencia a los medicamentos, tales como la prueba de la nitrato reductasa. Objetivo. En este estudio se propuso una prueba de sensibilidad a fármacos colorimétrica, rápida y directa, en un formato de microplacas utilizando medio sólido. Materiales y métodos. La precisión del diagnóstico se evaluó mediante la comparación del método de las proporciones con la prueba de la nitrato reductasa directa en placas. Se descontaminaron muestras positivas congeladas de esputo y se procesaron mediante el método de Petroff. La suspensión ya descontaminada se utilizó para hacer la prueba de la nitrato reductasa directa en medio 7H11, utilizando 1 µg/ml de rifampicina, 0,2 µg/ml de isoniacida, 2 µg/ml de ofloxacina, 6 µg/ml de de kanamicina, 2 µg/ ml de amicacina y 10 µg/ml de capreomicina. Se analizaron 84 muestras y los resultados del 69 % de ellas estuvieron disponibles en 21 días.Resultados. La sensibilidad y la especificidad de la prueba comparada con el método de las proporciones fueron de 98,5 y 100 % para la isoniacida, de 98,3 y 96,2 % para la rifampicina, de 91,7 y 100 para la kanamicina, de 78,8 y 97,3 % para la ofloxacina y de 100 y 100 % para la amikacina y la capremicina, respectivamente. Conclusión. Este nuevo formato de la prueba de la nitrato reductasa directa es un método preciso, rápido y económico para determinar el perfil de sensibilidad de M. tuberculosis y puede convertirse en una alternativa para los países con recursos limitados.