Avaliação da exposição de hepatócitos de Danio rerio ao Bisfenol A

Abstract

A introdução de substâncias tóxicas no ambiente pode causar efeitos locais e alterações sistêmicas dos ambientes. Entre estas substâncias estão os desruptores endócrinos (DEs), que são descartados de forma indevida no meio ambiente, e estão presentes no solo e sedimentos onde podem ser causadores de graves problemas aos organismos, incluindo os seres humanos. O bisfenol A (BPA) é um DEs comumente encontrado no ambiente e no corpo humano e provoca efeitos na fertilidade, imunidade, sistema nervoso e comportamento. O fígado é o principal órgão para o metabolismo e detoxificação de BPA, desta forma podendo estar mais exposto aos seus efeitos, e alterações hepáticas podem ser úteis como marcadores que indicam a exposição a estressores ambientais/xenobióticos. A linhagem celular ZFL é derivada de fígados de peixes adultos da espécie Danio rerio, e fornecem um sistema importante para estudos in vitro do efeito de agentes tóxicos em células hepáticas. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da exposição de hepatócitos de Zebrafish a diferentes concentrações de BPA (0,1µg/L; 1µg/L; 10µg/L; 50µg/L), avaliando a viabilidade celular através de três metodologias: teste de exclusão de Azul de Tripan, teste de MTT e teste de incorporação do corante Vermelho Neutro (VN). Pelo método de exclusão do Azul de Tripan comparando-se os tratamentos de BPA no mesmo tempo, foi observado diminuição significativa na viabilidade celular em 30min nas concentrações 10μg/L e 50μg/L, o que não foi observado para os tempos de 24h e 48h. A baixa viabilidade observada no tempo 30 min pode estar relacionada a mecanismos de detoxificação (MXR) que só foram ativados nos tempos de 24h e 48h devido ao curto tempo de exposição, podendo estes mecanismos serem tempo e concentração dependentes em ZFL expostos ao BPA. Pelos métodos de MTT e VN foi observado um aumento significativo ao longo do tempo para todos os tratamentos, provavelmente devido à proliferação celular, entretanto, a concentração 50μg/L de BPA foi estatisticamente menor que os demais tratamentos em 30 min, 24h e 48h (MTT) e 24h e 48h (VN) em relação ao controle, o que pode indicar que as mitocôndrias, e mais tardiamente as membranas lisossomais, sejam alvos mais imediatos do efeito do BPA em ZFL. Pode-se concluir que o BPA induziu efeitos de diminuição de proliferação em ZFL expostas às concentrações 10μg/L e 50μg/L verificado pelos métodos de viabilidade celular analisados, sendo que os testes MTT e VN foram mais sensíveis ao verificar efeitos em maior tempo de exposição.

The introduction of toxic substances in the environment can cause local effects and systemic changes of environments. Among these substances are the endocrine desruptores (EDs), which are improperly disposed in the environment, and are present in soil and sediment which may be causing serious problems for organisms, including humans. Bisphenol A (BPA) is a EDs commonly found in the environment and in the human body and causes effects on fertility, immunity, nervous system and behavior. The liver is the main organ for metabolism and detoxificationof BPA, in this way may be more exposed to its effects. Liver abnormalities may be useful as markers that indicate exposure to environmental / xenobiotics stressors. The ZFL cell is derived from fish liver of adult zebrafish, and provide an important system for in vitro studies of toxic agents effect in liver cells. Thus, the aim of this study was to evaluate the effects of exposure of zebrafish hepatocytes to different concentrations of BPA (0.1μg/L; 1μg/L, 10mg/L; 50mg/L), assessing cell viability through three methods: Trypan Blue exclusion assay, MTT assay and Neutral Red test (VN). By Trypan Blue exclusion method comparing the BPA treatments at the same time, a significant decrease was observed in the cell viability for 30min at concentrations of 10mg/L and 50mg/L, which was not observed for 24 times and 48h. The low viability observed in time 30min can be related to detoxification mechanisms (MXR) that were activated only in times of 24h and 48h due to the short exposure time, these mechanisms can be time- and concentration- dependent in ZFL exposed to BPA. For the MTT and VN methods was observed a significant increase over time for all treatments, probably due to cell proliferation, however, concentration 50 mg/L of BPA was statistically lower than the other treatments for 30min, 24h and 48h (MTT) and 24h and 48h (VN) compared to the control group, which may indicate that mitochondria, and later the lysosomal membranes, are targets of more immediate effect of BPA in ZFL. It can be concluded that BPA induced proliferation lowering effects in ZFL exposed to concentrations of 10mg/L and 50mg/L verified by the analyzed methods of cell viability, and the MTT and VN tests were more sensitive to verify effects of longer exposition.