Ação cardioprotetiva da fração ácida do extrato de Ilex paraguariensis St. Hil (Aquafoliaceae) em miocárdio de Rattus norvegicus durante a isquemia e reperfusão experimental in vivo

Abstract

A doença cardiovascular é a causa líder de morte no mundo e no Brasil. Nas últimas décadas, alcançou 32% das causas de mortalidade geral. A isquemia e a reperfusão no miocárdio levam a mudanças metabólicas e da função cardíaca, incluindo depressão na atividade contrátil e mesmo necrose tecidual. É sabido que os habitantes do interior dos estados brasileiros dependem de produtos naturais para os primeiros cuidados de saúde. A ervamate Ilex paraguariensis é comumente utilizada nos estados sul, sudeste e centro-oeste do Brasil para preparação de bebidas alimentícias e estimulantes, como o chimarrão. Vem sendo mundialmente consumida e utilizada para obtenção de produtos fitoterápicos. Considerando que os problemas da isquemia e reperfusão (I/R), estão relacionados a eventos oxidativos e a existência de produtos naturais com potencial para a redução dos danos miocárdicos, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de uma fração ácida rica em flavonóides do extrato I. paraguariensis (Ip), no modelo de isquemia e reperfusão induzidas in vivo em Rattus norvegicus. Ratos foram divididos em 4 grupos: Controle (animais submetidos a toracotomia sem oclusão da coronária anterior descendente esquerda); I/R (submetidos a 15 min de isquemia e 15 min de reperfusão); I/R+Ip (além de I/R o grupo recebia injeção i.v. de fração ácida rica de flavonóides do extrato de I. paraguariensis); e I/R+Ip+L-NAME (além do protocolo de I/R+Ip o grupo recebeu o inibidor da óxido nítrico sintase L-NAME). Ao final da I/R foi injetado (i.v.) 0,5mL de Azul dde Evans 10% para a identificação da área de risco. Os corações foram congelados e fatiados para que esta área fosse medida. Após, as fatias foram incubadas em TTC 1% para demarcação do tecido viável e não-viável. Para aumentar o contraste entre as diferenças no tecido as amostras foram incubadas em formalina 10%. As imagens foram analisadas no software Image Tool. Para determinação da geração de espécies reativas de oxigênio amostras do tecido cardíaco foram homogeneizadas, centrifugadas e a concentração de proteínas foi verificada pelo método de Biureto. Após as amostras foram distribuídas em microplacas e foi acrescido H2DCF-DA que na presença de ERRO gera um composto fluorescente. As placas foram lidas em fluorímetro (488nm de excitação e 525nm de emissão). A capacidade antioxidante contra radicais peroxil foi avaliada. A metodologia é conduzida como o teste para a geração de ERO. No entanto, neste caso a fluorescência produzida pelo DCF é aumentada por ABAP. As leituras foram realizadas em fluorímetro (485nm de excitação e 520nm de emissão). Para a determinação da peroxidação lipídica amostras do miocárdio foram homogeneizadas e submetidas a um método de reação de MDA com TBA em condições á altas temperaturas e meio ácido. Esta reação gera uma fluorescência que foi lida em fluorímetro (515nm excitação e 553nm de emissão). Animais tratados com a fração ácida de flavonóides de Ip demonstraram redução nas áreas de risco e infarto quando comparados ao ratos I/R. A avaliação do estado oxidativo demonstrou que os animais submetidos a I/R e tratados com o extrato não apresentaram os clássicos efeitos antioxidantes dos flavonóides de redução da condição de estresse oxidativo do tecido. Ainda assim o efeito cardioprotetor observado na redução da área de lesão, nos leva a sugerir que outros mecanismos que não aqueles antioxidativos, estejam sejam desencadeados pelos flavonóides da Ip, como a produção de NO e seu posterior benefício via vasodilatação, melhora da perfusão miocárdica e da função cardíaca durante a I/R.A doença cardiovascular é a causa líder de morte no mundo e no Brasil. Nas últimas décadas, alcançou 32% das causas de mortalidade geral. A isquemia e a reperfusão no miocárdio levam a mudanças metabólicas e da função cardíaca, incluindo depressão na atividade contrátil e mesmo necrose tecidual. É sabido que os habitantes do interior dos estados brasileiros dependem de produtos naturais para os primeiros cuidados de saúde. A ervamate Ilex paraguariensis é comumente utilizada nos estados sul, sudeste e centro-oeste do Brasil para preparação de bebidas alimentícias e estimulantes, como o chimarrão. Vem sendo mundialmente consumida e utilizada para obtenção de produtos fitoterápicos. Considerando que os problemas da isquemia e reperfusão (I/R), estão relacionados a eventos oxidativos e a existência de produtos naturais com potencial para a redução dos danos miocárdicos, este trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de uma fração ácida rica em flavonóides do extrato I. paraguariensis (Ip), no modelo de isquemia e reperfusão induzidas in vivo em Rattus norvegicus. Ratos foram divididos em 4 grupos: Controle (animais submetidos a toracotomia sem oclusão da coronária anterior descendente esquerda); I/R (submetidos a 15 min de isquemia e 15 min de reperfusão); I/R+Ip (além de I/R o grupo recebia injeção i.v. de fração ácida rica de flavonóides do extrato de I. paraguariensis); e I/R+Ip+L-NAME (além do protocolo de I/R+Ip o grupo recebeu o inibidor da óxido nítrico sintase L-NAME). Ao final da I/R foi injetado (i.v.) 0,5mL de Azul dde Evans 10% para a identificação da área de risco. Os corações foram congelados e fatiados para que esta área fosse medida. Após, as fatias foram incubadas em TTC 1% para demarcação do tecido viável e não-viável. Para aumentar o contraste entre as diferenças no tecido as amostras foram incubadas em formalina 10%. As imagens foram analisadas no software Image Tool. Para determinação da geração de espécies reativas de oxigênio amostras do tecido cardíaco foram homogeneizadas, centrifugadas e a concentração de proteínas foi verificada pelo método de Biureto. Após as amostras foram distribuídas em microplacas e foi acrescido H2DCF-DA que na presença de ERRO gera um composto fluorescente. As placas foram lidas em fluorímetro (488nm de excitação e 525nm de emissão). A capacidade antioxidante contra radicais peroxil foi avaliada. A metodologia é conduzida como o teste para a geração de ERO. No entanto, neste caso a fluorescência produzida pelo DCF é aumentada por ABAP. As leituras foram realizadas em fluorímetro (485nm de excitação e 520nm de emissão). Para a determinação da peroxidação lipídica amostras do miocárdio foram homogeneizadas e submetidas a um método de reação de MDA com TBA em condições á altas temperaturas e meio ácido. Esta reação gera uma fluorescência que foi lida em fluorímetro (515nm excitação e 553nm de emissão). Animais tratados com a fração ácida de flavonóides de Ip demonstraram redução nas áreas de risco e infarto quando comparados ao ratos I/R. A avaliação do estado oxidativo demonstrou que os animais submetidos a I/R e tratados com o extrato não apresentaram os clássicos efeitos antioxidantes dos flavonóides de redução da condição de estresse oxidativo do tecido. Ainda assim o efeito cardioprotetor observado na redução da área de lesão, nos leva a sugerir que outros mecanismos que não aqueles antioxidativos, estejam sejam desencadeados pelos flavonóides da Ip, como a produção de NO e seu posterior benefício via vasodilatação, melhora da perfusão miocárdica e da função cardíaca durante a I/R.

Aim of the study. Cardiovascular disease is the leading cause of death worldwide. Ischemia and myocardial infarction leads to changes in metabolism and cardiac function, including depression in contractile activity and even tissue necrosis. It is known that the inhabitants of the interior of the Brazilian states rely on natural products for the first health care. Mate Ilex paraguariensis is commonly used in south, southeast and central west of Brazil for the preparation of food beverages and stimulants, such as "mate". As many natural products have potential to reduce myocardial damage, and can be used as adjuvant to traditional therapy given its acceptance among populations, this study aimed to evaluate the effects of an acidic fraction, rich flavonoids extract from I. paraguariensis (Ip), in the model of experimental I/R in vivo in Rattus norvegicus. Materials and Methods. Rats were divided into four groups: control, I /R (15 min I/ 15 min R); I /R + Ip (I/R and iv injection of acidic fraction, rich flavonoid extract of Ip) and I/R + Ip + L-NAME (I /R + Ip, and treatment with nitric oxide synthase inhibitor L-NAME). The risk and infarcted areas, by Evans Blue and Triphenyl Tetrazolium chloride were determinate. Generation of reactive oxygen species (assayed by 2´,7´-dichlorodihydrofluorecein diacetate indicator), lipid peroxidation (reaction of malondialdehyde) and antioxidant competence (against peroxyl radicals assayed by the generator 2,2´-azobis 2 methylproprionamidine dihydrochloride) of the myocardium were evaluated. Results. Animals treated with the acidic fraction of flavonoids Ip showed reduction at risk and infarcted areas when compared to I/R rats. Animals subjected to I/R and treated with the extract did not show the classic antioxidant effects of flavonoids to reduce oxidative stress. Conclusions. The cardioprotective effect observed in the reduction of lesion area, leads us to suggest that flavonoids in the preparation have been able to directly or indirectly stimulate NO production and may have led to improved myocardium perfusion and cardiac function during ischemia by stimulating the repair of myocardial damage and consequent reduction of risk and infarcted areas.