Ação cardioprotetora da 3,5-dipalmitoil-nifedipina em cultura de cardioblastos submetidos à condição de isquemia e reperfusão

Abstract

Este trabalho investigou os efeitos agudos da nifedipina, um fármaco bloqueador de canal de cálcio utilizado como anti-hipertensivo, e seu híbrido graxo, a 3,5- dipalmitoil-nifedipina, formada de duas cadeias de ácido palmítico ligadas as extremidades da nifedipina. Sua ação foi estudada durante a indução da condição de isquemia e reperfusão em células cardíacas da linhagem H9c2 (cardioblastos) e comparada aos efeitos do endocanabinoide anandamida. As células foram mantidas em meio DMEM suplementado com soro fetal de bovino (10%), e antibiótico e antimicótico (1%). As concentrações utilizadas dos fármacos foram de 10 e 100µM. Avaliou-se a viabilidade celular utilizando o ensaio colorimétrico de MTT, a indução de apoptose e necrose por microscopia de fluorescência e a geração de espécies reativas de oxigênio por fluorimetria. Cardioblastos (1x105 células/mL) receberam as drogas previamente a indução de hipóxia em placas de 24 ou 96 poços (conforme o ensaio a ser realizado) permanecendo em tratamento por 30 minutos, tempo da hipóxia. Os grupos experimentais foram: controle (cardioblastos meio de cultura DMEM), H/R (cardioblastos em meio de cultura DMEM + indução da hipóxia e reoxigenação - H/R), jejum (cardioblastos em PBS), jejum + H/R (cardioblastos em PBS + indução da hipóxia e reoxigenação), jejum + veículo (cardioblastos em PBS + 10% do veículo dos fármacos - DMSO), jejum + H/R + veículo (cardioblastos em PBS + 10% DMSO + indução da hipóxia e reoxigenação), anandamida (cardioblastos em jejum PBS + AEA 10 ou 100 µM), anandamida + H/R (cardioblastos em jejum PBS + AEA 10 ou 100 µM + indução da hipóxia e reoxigenação), nifedipina (cardioblastos em jejum PBS + NIF 10 ou 100 µM), nifedipina + H/R (cardioblastos em jejum PBS + NIF 10 ou 100 µM NIF + indução da hipóxia e reoxigenação), 3,5- dipalmitoil-nifedipina (cardioblastos em jejum PBS + DPN 10 ou 100 µM DPN) e 3,5- dipalmitoil-nifedipina (cardioblastos em jejum PBS + DPN 10 ou 100 µM DPN + indução da hipóxia e reoxigenação). Todas moléculas testadas reduziram o estresse oxidativo quando comparadas ao grupo veículo. A viabilidade celular observada após ao processo de isquemia e reperfusão, aumentou quando as células eram tratadas com anandamida em ambas as doses e com a 3,5- dipalmitoil-nifedipina na concentração de 100 µM. Demonstrou-se por tanto, que o processo hibridização de duas cadeias de ácido palmítico a uma molécula de nifedipina atribuiu um maior efeito cardioprotetor à molécula, reduzindo os danos provocados pela isquemia e reperfusão em cultura de cardioblastos.

Knowing that the process of myocardial ischemia is a global health problem this study investigated, for the first time, the acute effects of the calcium channel blocker nifedipine and its new fatty hybrid with palmitic acid, the 3,5-dipalmitoyl-nifedipine, comparing to the endocannabinoid anandamide, during the process of induction of ischemia and reperfusion in H9c2 heart cells of the strain (cardiomyoblast). Cardiomyoblast (1x105 cells/ml) were treated in 24 or 96 well plates (according to the performed test) remaining with the treatment until the end of hypoxia induction. After this, the cells were distributed into the following groups: control (in DMEM culture medium), H/R (in DMEM culture medium + induction of hypoxia and reoxygenation), starvation (in PBS), starvation + H/R (PBS + induction of hypoxia and reoxygenation), starvation + vehicle (PBS + DMSO), starvation + H/R (PBS + DMSO + induction of hypoxia and reoxygenation), anandamide (AEA + starvation ), anandamide + H/R (AEA + starvation + induction of hypoxia and reoxygenation), nifedipine (NIF + starvation), nifedipine + H/R (NIF + starvation + induction of hypoxia and reoxygenation), 3,5-dipalmitoyl-nifedipine (DPN + starvation) and 3,5-dipalmitoyl- nifedipine + H/R (DPN + starvation + induction of hypoxia and reoxygenation). The molecules were tested at concentrations of 10 and 100 µM, treated 24h after assembly of the experimental plates and immediately before the H/R. We assessed cell viability using the MTT colorimetric assay, induction of apoptosis and necrosis by fluorescent microscopy and ROS generation was by fluorimetry. All molecules tested managed to reduce the levels of oxidative stress compared to the starvation + vehicle group. Cell viability was enhanced when cells were induced by ischemia and reperfusion process, only in the treatments with both doses of anandamide and 3,5-dipalmitoyl-nifedipine at a concentration of 100 µM. Those same treatments also reduced cell death. It is shown therefore that the process of hybridization of nifedipine to two palmitic acid chains at a assigns a greater cardioprotective effect to this molecule, reducing the damage caused by ischemia and reperfusion in cardiomyoblast culture.