Relação entre a aquisição da resistência a múltiplas drogas e marcadores de células-tronco em linhagens eritroleucêmicas humanas

Abstract

A resistência a múltiplas drogas (MDR) pode ser caracterizada pela capacidade de exportar diferentes compostos químicos para o meio extracelular, sendo a principal causa na falta de sucesso na terapia do câncer. Atualmente uma possível relação do fenótipo MDR e a presença de células-tronco cancerígenas (CTCs) nesta patologia tem sido estudada. O objetivo desta tese foi investigar a relação entre a presença de células-tronco (CT), diferenciação celular e o fenótipo MDR nas linhagens celulares eritroleucêmicas humanas K562, K562-Lucena e FEPS. O silenciamento do pseudogene OCT4-PG1 na FEPS com o plasmídeo shRNA, a sensibilidade da linhagem FEPS silenciada aos quimioterápicos vincristina (VCR) e daunorrubicina (DNR) por exclusão por azul de tripan, transformação das células K562 com concentrações crescentes de VCR e DNR, análise de expressão das proteínas ABCB1 e OCT-4 por citometria de fluxo foi realizado. Ademais, foi analisada a interação do OCT4-PG1 com transportadores pela rede STRING, atividade das proteínas de efluxo ABCB1 e ABCC1, análises de expressão gênica de ABCB1, ABCC1, ALOX5, OCT-4 por PCR-tempo real nas células K562, K562-Lucena, FEPS, K562-Lucena e FEPS silenciadas para ABCB1. As células FEPS silenciadas para OCT4-PG1 apresentaram menores níveis de mRNA e proteína OCT-4, diminuição na expressão gênica, proteica e atividade da proteína ABCB1, aumento na expressão gênica de ALOX5 e ABCC1, bem como a atividade deste transportador, sensibilidade aos quimioterápicos e a rede STRING demonstrou interação direta de OCT4-PG1 com OCT-4, SOX2 e NANOG e interação indireta com os transportadores ABC. As células K562 apresentaram sensibilidade com 15, 30 e 60 nM de VCR a partir de 48h e a partir de 33,35 nM de DNR em 96h. As células K562 transformadas com os quimioterápicos VCR e DNR apresentaram aumento na expressão gênica e proteica ABCB1, diminuição na expressão gênica ALOX5 já nas concentrações intermediárias. As células K562-Lucena silenciadas para ABCB1 aumentaram a expressão gênica ABCC1 enquanto este gene diminuiu na FEPS silenciadas para ABCB1. Ambas linhagens K562-Lucena e FEPS silenciadas para ABCB1 aumentaram a expressão gênica de ALOX5. Os dados mostram que mudanças nos perfis de marcadores de células-tronco OCT-4 e ALOX5, modificaram a manutenção e aquisição do fenótipo MDR nas linhagens celulares K562-Lucena e FEPS.

Multiple drug resistance (MDR) can to be characterized by the ability to export different chemical compounds to the extracellular medium, being the main cause in the lack of success in cancer therapy. Currently a possible relationship of the MDR phenotype and the presence of cancer stem cells (CSCs) in this pathology has been studied. The aimed of this thesis was to investigate the relationship between the presence of stem cells (SC), cell differentiation and MDR phenotype in human erythroleukemic cell lines K562, K562-Lucena and FEPS. The silencing in the pseudogene OCT4-PG1 in the FEPS line with shRNA plasmid, sensitivity of FEPS silenced to chemotherapy vincristine (VCR) and daunorubicin (DNR) (trypan blue exclusion), transformation of K562 cells with increasing concentrations of VCR and DNR, analysis of protein expression ABCB1 and OCT-4 by flow cytometry were performed. In addition, was analyzed the interaction of OCT4-PG1 with transporters by STRING network, activity of ABCB1 and ABCC1 efflux proteins, gene expression analyzes of ABCB1, ABCC1, ALOX5, OCT-4 by PCR-time real in K562, K562-Lucena, FEPS, K562-Lucena and FEPS silenced to ABCB1 cells. OCT4-PG1 silenced FEPS cells showed lower levels of mRNA and OCT-4 protein, decreased gene, protein expression and activity ABCB1, increased gene expression of ALOX5 and ABCC1, as well as the activity of this transporter, sensitivity to chemotherapeutics and the STRING network demonstrated direct OCT4-PG1 interaction with OCT-4, SOX2 and NANOG and indirect interaction with ABC transporters. K562 cells exhibited sensitivity at 15, 30 and 60 nM VCR from 48h and from 33.35 nM DNR in 96h. The transformed K562 cells with the chemotherapy VCR and DNR showed increase in the gene expression and protein ABCB1, decrease in the ALOX5 gene expression already in the intermediate concentrations. K562-Lucena cells silenced for ABCB1 increased the ABCC1 gene expression while this gene decreased in the silenced FEPS cells silenced for ABCB1. Both lines K562-Lucena and FEPS cells silenced for ABCB1 increased the ALOX5 gene expression. The data show that changes in the profiles of stem cells markers, OCT-4 and ALOX5 modified the maintenance and acquisition of the MDR phenotype in K562-Lucena and FEPS cell lines.