Influência da ouabaína no fenótipo de resistência a múltiplas drogas em linhagens eritroleucêmicas humanas

Abstract

O fenótipo de resistência à múltiplas drogas (MDR) é um grande desafio no tratamento do câncer. Assim, pesquisas buscam encontrar novas substâncias que sejam capazes de superar este fenótipo. Dentre suas inúmeras características, a mais estuda é a presença de bombas de efluxo, como a ABCB, a qual realiza a extrusão de diversos fármacos. A ouabaína, um glicosídeo cardíaco, tem despontado como um potencial anti-cancer porém, poucas pesquisas investigam a relação da OUA como o fenótipo MDR. O presente trabalho utilizou linhagens eritroleucêmicas humanas sensível (K562) e resistentes a múltiplas drogas (K562-Lucena e FEPS), para investigar a atuação da OUA sobre o fenótipo MDR. Para avaliar o possível efeito citotóxico da OUA foram utilizados ensaios de atividade mitocondrial por MTT, ensaio de viabilidade celular por exclusão por azul de trypan e quantificação de morte celular por microscopia de fluorescência. Ensaios in silico e in vitro foram realizados para investigar a possível atuação da OUA sobre ABCB1. Sendo assim, os resultados demonstram a capacidade da OUA, em gerar citotoxicidade, na concentração de 100 nM, em todas as linhagens. Foi observada uma diminuição na atividade mitocondrial em todas as linhagens expostas a 100 nM de OUA, aliada a uma diminuição no número de células viáveis, além de uma diminuição na viabilidade celular nas linhagens K562 e K562-Lucena. Ainda, foi constatada morte por apoptose em todas as linhagens, e nas linhagens resistentes também foi observada morte por necrose. A concentração de 10 nM não se mostrou citotóxica, porém diminuiu o número de células viáveis na linhagem FEPS. O docking molecular, demonstrou, pela primeira vez, que a OUA pode interagir com ABCB1, contudo sua atividade não foi alterada, uma vez que não houve efeito na associação da OUA com os quimioterápicos (VCR e DNR). Porém, a OUA foi capaz de modular a expressão gênica e proteica de ABCB1 de formas distintas nas linhagens resistentes, de acordo com a concentração. A concentração de 10 nM diminui a expressão proteica em ambas as linhagens resistentes, mas na linhagem FEPS além da expressão proteica, houve uma diminuição na expressão gênica. A concentração de 100 nM gerou um aumento na expressão proteica de ABCB1 em K562-Lucena. Dessa forma, concluímos que a ação citotóxica da OUA nas linhagens resistentes, está associada a uma diminuição na atividade mitocondrial, sem agir diretamente sobre ABCB1, mas modulando a expressão gênica e proteica dessa proteína.

The multiple drug resistance phenotype (MDR) is a major challenge in the treatment of cancer. Thus, researches seek to find new substances that are capable of overcoming this phenotype. Among its many characteristics, the most studied is the presence of efflux pumps, such as ABCB1, which performs the extrusion of various drugs. Ouabain (OUA), a cardiac glycoside, has emerged as an anti-cancer potential, however, few studies investigate the relationship of OUA to the MDR phenotype. The present work used sensitive (K562) and multiple drug resistant (K562-Lucena and FEPS) erythroleukemic human lineages to investigate the OUA's performance on the MDR phenotype. To evaluate the possible cytotoxic effect of OUA, MTT mitochondrial activity assays, trypan blue exclusion cell viability assays and quantification of cell death by fluorescence microscopy were used. In silico and in vitro assays were performed to investigate the possible action of OUA on ABCB1. Thus, the results demonstrate the ability of the OUA to generate cytotoxicity at a concentration of 100 nM in all lineages. A decrease in mitochondrial activity was observed in all cell lines exposed to 100 nM OUA, together with a decrease in the number of viable cells, as well as a decrease in cell viability in the K562 and K562-Lucena cell lines. Moreover, death by apoptosis was observed in all lineages, and necrosis death was also observed in resistant strains. The concentration of 10 nM was not cytotoxic, but decreased the number of viable cells in the FEPS lineage. Molecular docking demonstrated for the first time that OUA can interact with ABCB1, but its activity was not altered, since there was no effect on the association of OUA with chemotherapeutics (VCR and DNR). However, OUA was able to modulate the gene and protein expression of ABCB1 in different ways in the resistant cell lines, according to the concentration. The concentration of 10 nM decreases the protein expression in both resistant strains, but in the FEPS line besides the protein expression, there was a decrease in the gene expression. The concentration of 100 nM generated an increase in the protein expression of ABCB1 in K562-Lucena. Thus, we conclude that the cytotoxic action of OUA in resistant cell lines is associated with a decrease in mitochondrial activity, without acting directly on ABCB1, but modulating the gene and protein expression of this protein.