Mecanismos de toxicidade do azul de metileno em hepatócitos de Danio rerio

Abstract

Devido à grande importância do azul de metileno, principalmente como agente fotossensibilizador, estudos a fim de entender mais sobre seus mecanismos de ação e alvos celulares têm sido propostos. O presente trabalho analisou e comparou os mecanismos de toxicidade do azul de metileno em hepatócitos do peixe Danio rerio (linhagem celular ZFL), tanto na ausência quanto na presença de luz visível. Para isso, as células foram expostas a concetrações equitóxicas de azul de metileno correspondentes a concentração efetiva mediana em 24 h (CE50) para cada tratamento (38 µg/L- azul de metileno e 5,6 µg/L- azul de metileno na presença de luz visível). Foi observado um aumento significativo nos níveis de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio após 3 h do tratamento nas células que receberam apenas azul de metileno, sendo que no tratamento com azul de metileno e luz visível este aumento só foi observado após 12 h. Todos os tratamentos com azul de metileno (sozinho ou na presença de luz visível) acarretaram em aumento nos danos ao DNA após 3 e 6h, sendo que o tratamento com azul de metileno na ausência de luz promoveu a geração de danos do tipo 8-oxoG. Morte celular por necrose ocorreu em todos os tempos analisados nos dois tratamentos, já a morte por apoptose foi observada apenas a partir de 6 h após o tratamento com azul de metileno na presença de luz visível e a partir de 12 h após o tratamento com azul de metileno sozinho. O nível de expressão de genes relacionados à parada do ciclo celular e apoptose (cdkn1, bax, noxa, bcl-2 e bcl-xl) foi alterado após o tratamento com azul de metileno na presença de luz visível, enquanto que no tratamento com azul de metileno sozinho, apenas o gene bcl-2 apresentou diferenças significativas em sua expressão em relação ao controle. Assim, a linhagem ZFL é sensível à ação fotodinâmica do azul de metileno, e o azul de metileno na presença ou não de luz visível é capaz de gerar danos no DNA e induzir a apoptose nesta linhagem. No entanto, as vias que conduzem à apoptose na linhagem ZFL parecem ser distintas em função do tratamento. Palavras-chave: azul de metileno, ação

Methylene blue (MB) is a widely utilized compound, mostly as photosensitizing agent. The aim of the present study was to compare the mechanisms of methylene blue action in zebrafish cell line, both in the absence (MB alone) and in the presence of photosynthetically active radiation (PAR; MB+PAR). For this purpose, cells were exposed to equitoxic concentrations of MB corresponding to 24 h median effective concentration (EC50) in each treatment (MB- 38 µg/L and MB+PAR- 5.6 µg/L). In this situation, there was a significant increase of the levels of reactive oxygen and nitrogen species (RONS) 3 h after treatment of cells receiving only MB, while for the treatment MB+PAR this increase was only observed 12 h after treatment. All treatments with MB (alone or in the presence of PAR) resulted in increases in DNA damage after 3 and 6 h, and the MB treatment alone promoted the generation of 8-oxoG. Necrotic cell death was observed in all periods analyzed (3, 6, 12 and 24 h) in both treatments. However, cell death by apoptosis was observed from 6 h after treatment with MB + PAR and 12 h after treatment with MB alone. The expression of genes related to cell cycle arrest (cdkn1) and apoptosis (bcl-2, bcl-xl, bax1 and noxa) was altered after treatment with MB+PAR. However, only expression of bcl-2 gene was influenced by MB alone. Thus, this zebrafish cell line is sensitive to photodynamic action of methylene blue, and methylene blue both alone and in the presence of PAR are able to generate DNA damage and to induce apoptosis in this lineage. However, the pathways leading to apoptosis in this cell line appear to be different according to methylene blue exposure (in presence or absence of PAR). Keywords: methylene blue, photodynamic