Abstract:
A C-ficocianina (C-FC), pigmento fotossintético de cianobactérias como a Spirulina platensis, possui capacidade antitumoral. Contudo, os mecanismos responsáveis pelo efeito antitumoral permanecem incompletamente compreendidos e o seu papel no fenótipo de resistência a múltiplas drogas (MDR) é bastante restrito. O fenótipo MDR gera insucessos no tratamento quimioterápico, sendo importante investigá-lo. O objetivo desta tese foi avaliar o efeito antitumoral e anti-MDR da C-FC e os mecanismos para geração destes efeitos, em três linhagens eritroleucêmicas humanas: K562 (não MDR); K562-Lucena (MDR/ superexpressão da proteína ABCB1 para efluxo de drogas) e FEPS (MDR/ superexpressão das proteínas ABCB1 e ABCC1 para efluxo de drogas). Realizou-se uma revisão de literatura sobre o tema, além de testes de viabilidade celular (exclusão por azul de Tripan e MTT), verificação de marcação por C-FC por citometria de fluxo, análise de atividade das proteínas de efluxo e avaliação de níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS) por fluorimetria, análise de expressão gênica por PCR tempo real (genes para proteínas de efluxo: ABCB1; ABCC1; genes para proteínas produtoras de mediadores inflamatórios: PTGS2 e ALOX5), e análise de interação da C-FC com: ABCB1, ABCC1 e com os quimioterápicos vincristina (VCR) e daunorrubicina (DNR) por docking. Com a revisão constatou-se a ubiquidade de alvos celulares e mecanismos de ação da C-FC, bem como o potencial anti-MDR da molécula. A C-FC inibiu a proliferação nas linhagens K562, K562-Lucena e FEPS (sendo K562 a mais sensível e FEPS a mais resistente), sem gerar citotoxicidade para os macrófagos peritoneais de Mus musculus. A C-FC interagiu de modo diferencial com as proteínas de efluxo ABCB1 e ABCC1 afetando a atividade apenas de ABCC1. A mudança de atividade da ABCC1 possivelmente gerou o efluxo da C-FC, pois a FEPS (única linhagem com ABCC1) foi aquela com menor marcação por C-FC e mais resistente. No docking proteína-ligante a C-FC interagiu com VCR e DNR de modo semelhante, contudo o aumento de sensibilidade com a combinação C-FC/quimioterápico foi verificado apenas para C-FC + DNR, indicando que a formação de complexo C-FC/DNR deve modificar a interação de C-FC e/ou DNR com a ABCC1. Os mecanismos antitumorais não envolveram níveis significativos de apoptose em relação ao controle, reforçando o papel citostático da C-FC verificado nos ensaios de viabilidade. A C-FC aumentou os níveis de ROS para K562 e K562-Lucena, reduziu a expressão do gene ALOX5 para K562-Lucena e FEPS, além de aumentar a expressão de PTGS2 e ABCB1 para K562-Lucena. Para a linhagem K562-Lucena é possível que a expressão de PTGS2 e ABCB1 estejam relacionadas sendo ocasionadas provavelmente via ROS. A C-FC isoladamente gerou inibição de proliferação para K562 e K562-Lucena e combinada com DNR para a FEPS, sendo que o ROS parece estar envolvido na geração dos efeitos para K562 e K562-Lucena. A modulação da expressão gênica de ALOX5 parece ser um importante alvo celular da C-FC em células MDR, mesmo para linhagens mais resistentes como a FEPS. A C-FC tem capacidade anti-MDR isolada ou em combinação com DNR, sendo provável o envolvimento de vias de sinalização relacionadas a ROS e a modulação da expressão gênica para geração desse efeito.
The C-phycocyanin (C-PC), a photosynthetic pigment of cyanobacteria such as Spirulina platensis, has antitumor capacity. However, the mechanisms responsible for the antitumor effect remain incompletely understood and their role in the multidrug resistance (MDR) phenotype is quite restricted. The MDR phenotype generates failures in the chemotherapeutic treatment, being important to investigate it. The aim of this thesis was to evaluate the antitumor and anti-MDR effect of C-PC and the mechanisms to generate these effects, in three human erythroleukemic cell lines: K562 (non-MDR); K562-Lucena (MDR/ overexpression of protein ABCB1 for drugs efflux) and FEPS (MDR/ overexpression of proteins ABCB1 and ABCC1 for drugs efflux). We conducted a literature review, besides cell viability tests (Trypan blue exclusion and MTT), verification of C-PC labeling by flow cytometry, analysis of efflux proteins activity and evaluation of reactive oxygen species (ROS) levels by fluorimetry, gene expression analysis by real-time PCR (genes for efflux proteins: ABCB1; ABCC1; genes for inflammatory mediators: PTGS2 e ALOX5), and interaction analysis of C-PC with: ABCB1, ABCC1 and with the chemotherapeutic vincristine (VCR) and daunorubicin (DNR) by docking. With the review we verified the ubiquity of cellular targets and mechanisms of action of C-PC, as well as the anti-MDR potential of this molecule. The C-PC inhibited proliferation in the K562, K562-Lucena and FEPS cell lines (K562 being the most sensitive and FEPS the most resistant), without generating cytotoxicity for the peritoneal macrophages of Mus musculus. The C-PC interacted differentially with the ABCB1 and ABCC1 efflux proteins affecting activity only of ABCC1. The change in ABCC1 activity possibly generated C-PC efflux, since FEPS (single cell line with ABCC1) was the one with the lowest C-PC and the most resistant. In the protein-ligand docking the C-PC interacted with VCR and DNR in a similar way, however the increase of sensitivity with the combination C-PC/chemotherapeutic was verified only for C-PC+DNR, indicating that the formation of complex C-PC/DNR should modify the interaction of C-PC and/or DNR with ABCC1. Antitumor mechanisms did not involve significant levels of apoptosis in relation to the control, reinforcing the cytostatic role of C-PC verified in the viability tests. The C-PC increased levels of ROS for K562 and K562-Lucena, reduced expression of the ALOX5 gene for K562-Lucena and FEPS, and increased expression of PTGS2 and ABCB1 for K562-Lucena. For the K562-Lucena cell line it is possible that the expression of PTGS2 and ABCB1 are related being probably caused by ROS. The C-PC alone generated proliferation inhibition for K562 and K562-Lucena and combined with DNR for FEPS, and ROS appeared to be involved in the generation of effects for K562 and K562-Lucena. Modulation of ALOX5 gene expression appears to be an important cellular target of C-PC in MDR cells, even for more resistant cell lines such as FEPS. The C-PC has anti-MDR capability alone or in combination with DNR, probably with the involvement of ROS-related signaling pathways and the gene expression modulation for this effect.
