Efeitos da exposição crônica ao cobre em Poecilia vivipara (Bloch e Schneider, 1801) aclimatados à água salgada

Abstract

A acumulação e os efeitos do cobre (Cu) foram analisados após exposição crônica ao metal em filhotes de Poecilia vivipara aclimatados à água salgada. Em um primeiro experimento, filhotes recém-nascidos (<24 h) foram mantidos em condição controle (sem adição de Cu na água) ou expostos a diferentes concentrações de Cu (5, 9 e 20 µg/L) por 28 dias. O experimento foi realizado utilizando-se um sistema estático com renovação total do meio a cada 24 h. Os peixes foram mantidos em aquários de vidro contendo água salgada (salinidade 24), sob condições controladas de temperatura (28°C) e fotoperíodo (12 h claro:12 h escuro), aeração constante e alimentação diária ad libitum com ração comercial. Após tratamento, o consumo corporal de oxigênio foi medido e os peixes foram eutanasiados, medidos e pesados para o cálculo de índices zootécnicos (sobrevivência, taxa de crescimento específico, conversão alimentar aparente e fator de condição). A seguir, os peixes foram preservados inteiros para análise da acumulação de Cu, expressão de genes codificadores de proteínas transportadoras de Cu (CTR1 e ATP7B) e atividade de enzimas do metabolismo energético (piruvato quinase, lactato desidrogenase e citrato sintase). Em um segundo experimento, filhotes recém-nascidos foram mantidos em condição controle ou expostos às concentrações de Cu por 345 dias. Os peixes foram mantidos em aquários de vidro nas mesmas condições utilizadas no primeiro experimento. Após tratamento, os peixes foram eutanasiados, medidos e pesados para cálculo de índices zootécnicos (taxa de crescimento específico e ganho de peso), bem como preservados inteiros para medida da acumulação corporal de Cu ou tiveram seus tecidos dissecados para análise da acumulação tecidual (brânquias, fígado, intestino e músculo) de Cu, expressão tecidual (brânquias, fígado e intestino) do CTR1 e da ATP7B, bem como da atividade tecidual (brânquias, fígado e músculo) de enzimas envolvidas no metabolismo energético. Os resultados mostram que houve acumulação de Cu (corporal ou tecidual) nos peixes de ambos os experimentos, sendo esta dependente da concentração do metal no meio experimental e do tempo de exposição ao metal. Além disso, houve indução corporal da expressão do CTR1 e da ATP7B após exposição ao Cu por 28 dias, bem como da ATP7B após a exposição ao Cu por 345 dias. Após exposição ao Cu por 28 dias, não houve efeito do Cu no crescimento dos peixes, porém houve um aumento no consumo corporal de oxigênio dos peixes expostos a 9 e 20 µg/L Cu. Após 345 dias de exposição, foi observado 100% de mortalidade dos peixes expostos a 20 µg/L Cu, bem como redução no crescimento de machos expostos a 9 µg/L Cu e de fêmeas expostas a 5 e 9 µg/L Cu. Além disso, foi observado aumento na atividade da citrato sintase no fígado dos peixes expostos a 9 µg/L Cu. Estes resultados indicam que P. vivipara acumula o Cu em nível tecidual/corporal, sendo esta dependente da concentração de Cu na água salgada e do tempo de exposição ao metal. Eles sugerem ainda que a acumulação de Cu está associada a um aumento da expressão dos genes que codificam proteínas transportadoras de Cu (CTR1 e ATP7B) em tecidos envolvidos na homeostasia do metal. Mostram ainda que o Cu acumulado provoca efeito letal após exposição a uma concentração excessiva do metal (20 µg/L) e efeito subletal (redução no crescimento) após exposição aos atuais critérios brasileiros de qualidade para o Cu em água doce (9 µg/L) ou salgada (5 µg/L). Por fim, o efeito crônico do Cu no crescimento de P. vivipara parece estar relacionado a um aumento na demanda energética dependente do metabolismo aeróbico e/ou uma perturbação na função respiratória mitocondrial.

n the present study, we evaluated the accumulation and effects of copper (Cu) after chronic exposure to the metal in puppies of the guppy Poecilia vivipara acclimated to salt water. In a first experiment, newborn (<24 h) fish were kept under control condition (no Cu addition) or exposed to different Cu concentrations (5, 9 and 20 µg/L) for 28 days. Treatments were performed in triplicate using a static system with complete renewal of the experimental media every 24 h. Fish were kept in 1-L glass aquaria with sea water (24 ppt salinity) under controlled conditions (temperature: 28°C; photoperiod: 12 h light: 12 h dark cycle). Experimental media were continuously aerated and fish were daily fed ad libitum with commercial feed. After treatment, whole-body oxygen consumption was measured and fish were euthanized, measured (mm) and weighed (g) for calculation of zootechnical indexes (survival, specific growth rate, apparent feeding conversion and condition factor). They were then preserved entirely for analysis of whole-body Cu accumulation, expression of genes encoding Cu-transporting proteins (CTR1 and ATP7B) and activity of enzymes involved in energy metabolism (pyruvate kinase, lactate dehydrogenase and citrate synthase). In a second experiment, newborn (<24 h) fish were kept under control condition or exposed to the Cu concentrations for 345 days. They were maintained in 10-L glass aquaria under the same controlled experimental conditions described above for the 28-days experiment. After exposure, fish were euthanized, measured (mm) and weighed (g) for calculation of zootechnical indexes (specific growth rate and weight gain), as well as preserved entirely for measurement of whole-body Cu accumulation or dissected for analysis of Cu accumulation in tissues (gills, liver, gut and muscle), expression of genes encoding for Cu-transporting proteins in tissues (gills, liver and gut) and activity of enzymes involved in energy metabolism in tissues (gills, liver and muscle). Whole-body and tissue Cu accumulation were observed in fish exposed for 28 days and 345 days, respectively. In both cases, Cu accumulation was dependent on the concentration of the metal in the experimental medium. Also, there was an induction of CTR1 and ATP7B gene expression in whole-body and tissues of fish exposed for 28 days and 345 days, respectively. No significant effect on growth of fish exposed for 28 days was observed. However, there was an increase in whole-body oxygen consumption in fish exposed to 9 and 20 µg/L Cu. In the 345-days experiment, 100% mortality of fish was observed at 20 µg/L Cu. In addition, a reduction in growth was observed in male guppies exposed to 9 µg/L Cu and female guppies exposed to 5 and 9 µg/L Cu. Furthermore, an increase in citrate synthase activity was observed in liver of guppies exposed to 9 µg/L Cu. These findings indicate that puppies of P. vivipara accumulate Cu at the whole-body/tissue level. This accumulation is dependent on the Cu concentration in salt water and associated with an increase in the expression of genes encoding for Cu-transporting proteins such as CTR1 and ATP7B in tissues involved in Cu homeostasis (gills, liver and gut). Also, they show that Cu is lethal to fish chronically exposed to an excessive concentration of the metal (20 µg/L) or induces sublethal effect (growth reduction) when fish are chronically exposed to the current Brazilian criteria for Cu in fresh (9 µg/L) and sea water (5 µg/L). Finally, findings reported in the present study indicate that the observed effect on growth may be related to an increased demand for energy produced via aerobic metabolism and/or a disruption in mitochondrial respiratory function induced by chronic exposure of fish to waterborne Cu.