Abstract:
A atrazina (ATZ) é um agrotóxico utilizado na agricultura para controlar ervas daninhas. A sua utilização em larga escala, seu escoamento e lixiviação, tornaram-lhe um dos contaminantes de maior presença no ambiente aquático. Enzimas de biotransformação como o citocromo P450 (CYP) e a glutationa S-transferase (GST) participam de sua detoxificação. A atividade destas enzimas pode se mostrar aumentada nos organismos aquáticos expostos a contaminantes ambientais. A ATZ pode ainda causar efeitos nocivos ao nível reprodutivo em mamíferos, anfibos e peixes. Os prováveis mecanismos envolvidos nestes efeitos, incluem a modulação de vias esteroidogênicas pela ATZ, através do incremento da AMPc por inibição da fosfodiesterase, assim como a modução de múltiplas vias bioquímicas fundamentais da gametogênese e ovulação. Outro efeito negativo da ATZ seria a produção adicional de espécies reativas de oxigênio com conseqüente aumento de danos em estruturas celulares e DNA. A presente tese está estruturada em dois capítulos com os seguintes objetivos: 1) estimar a biotransformação de ATZ via GST em camarão e peixes de ambiente contaminado e cativeiro (referência), utilizando três abordagens: ensaio cinético da GST com substrato de amplo espectro (CDNB), ensaio cinético competitivo entre CDNB e ATZ e ensaio cinético de decaímento da ATZ, analisada por cromatografia líquida e espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS); e 2) avaliar efeitos da exposição à ATZ sobre os parâmetros de qualidade espermática e na regulação transcricional de genes-alvo relacionados a estes parâmetros em peixe-zebra (Danio rerio). Para o primeiro capítulo, foram utilizados extratos citosólicos de brânquia e hepatopâncreas de camarão Litopenaeus vannamei e brânquia e fígado de peixe Poecilia vivipara. Ensaios cinéticos com variações nas concentrações de CDNB e ATZ foram realizados a fim de construir gráficos de Lineweaver-Burk que permitiram inferir que a inibição causada pela ATZ era do tipo competitivo. A atividade basal estimada por ensaio cinético com CDNB sugeriu maior capacidade de detoxificação via GST em peixe que em crustáceo, maior em fígado que em brânquias e maior em peixe de local contaminado que de cativeiro. Padrões similares foram encontrados quando foi avaliado o decaimento da ATZ por LC-MS/MS. Por outro lado, a capacidade de biotransformação estimada pelo ensaio competitivo, utilizando CDNB e ATZ como substratos de competição, sugere maior atividade de GST com afinidade por ATZ em crustáceo que em peixe, e maior em peixes de cativeiro que de local contaminado. Aparentemente, os dois primeiros ensaios citados, foram mais apropriados para indicar a capacidade de biotransformação do que o ensaio competitivo. A inespecificidade do ensaio competitivo utilizado pode ter relação com a presença de diferentes isoformas de GST nas matrizes biológicas testadas. Para o segundo objetivo, peixes D. rerio foram expostos as concentrações nominais de ATZ de 0, 2, 10 e 100 µg.L-1 durante 11 dias. As concentrações de 2, 10 e 100 µg.L-1 ATZ testados causaram diminuição em diversos parâmetros espermáticos, como motilidade, funcionalidade mitocondrial e integridade de membrana, em relação ao grupo controle, porém não houve efeito na integridade do DNA. A repressão da expressão de genes relacionados da espermatogênese (SRD5A2 e CFTR) e proteção celular (SOD2, GPX, XPC) em gônadas de grupos expostos à ATZ sugerem que a ATZ afeta as vias gametogênicas e de proteção na gônada, podendo ser uma das possíveis causas para a redução da qualidade espermática. No fígado, a ATZ ativou a expressão de genes de detoxificação e antioxidante (CYP1A, GSTP e SOD2). Fatores de transcrição tais como AHR e NF-B, podem estar sendo ativados pela presença da ATZ e seus produtos oxidativos, e podem representar possíveis mecanismos de regulação transcricional envolvidos nestas respostas. Em suma, o presente estudo sugere que a capacidade de biotransformação de ATZ via GST é espécie-específica, órgão-específica e maior em peixes que habitam ambiente contaminado. Também sugere que concentrações ambientalmente relevantes de ATZ causam efeitos significativos ao nível reprodutivo em peixes macho, e que estes efeitos podem estar associados à regulação transcricional de genes-chave associados à espermatogênese e proteção celular.
Atrazine (ATZ) is a substance used in agriculture to control weeds. Its widespread use, drainage and leaching have made it one of the most important contaminants in the aquatic environment. Biotransformation enzymes such as cytochrome P450 (CYP) and glutathione S-transferase (GST) participate in its detoxification. The activity of these enzymes may be increased in aquatic organisms exposed to environmental contaminants. ATZ may also cause reproductive harm to mammals, amphibians and fishes. The probable mechanisms involved in these effects include the modulation of steroidogenic pathways by ATZ, through the increase of cAMP by inhibition of phosphodiesterase, as well as the modulation of multiple biochemical pathways fundamental to gametogenesis and ovulation. Another negative effect of ATZ would be the additional production of reactive oxygen species with consequent increase of damage in cellular structures and DNA. The present thesis is structured in two chapters with following objectives: 1) to estimate the biotransformation of ATZ via GST in shrimp and contaminated environment fish and captivity (reference) using three approaches: GST kinetic assay with broad spectrum substrate (CDNB), competitive kinetic assay between CDNB and ATZ, and kinetic assay of decay of ATZ, analysed by Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); and 2) to evaluate effects of exposure to ATZ on the parameters of sperm quality and on the transcriptional regulation of target genes related to these parameters in zebrafish (Danio rerio). For first chapter, we used cytosolic extracts of gill and hepatopancreas of shrimp Litopenaeus vannamei and gill and liver of fish Poecilia vivipara. Kinetic assays with varying concentrations of CDNB and ATZ were performed in order to develop Lineweaver-Burk plots that allowed to infer that the type of inhibition caused by ATZ was of the competitive type. Basal activity estimated by kinetic assay with CDNB suggested a higher detoxification capacity via GST in fish than in crustacean, higher in liver than in gills and higher in fish from contaminated environment than from captivity. Similar patterns were found when ATZ decay was evaluated by LC-MS/MS. On other hand, biotransformation capacity estimated by competitive assay, using CDNB and ATZ as competition substrates, suggests higher GST activity with ATZ affinity in crustacean than in fish, and higher in captivity fish than in contaminated environment. Possibly, first two trials cited, have more realistically reproduced the biotransformation capacity than competitive assay. The non-specificity of the competitive assay used, which could have its results masked by GST isoforms that have no affinity for ATZ, but rather for CDNB, could be one of the causes of the contradictory results obtained using this approach. For the second objective, D. rerio fish were exposed to nominal concentrations of ATZ of 0, 2, 10 and 100 µg.L-1 for 11 days. The concentrations of 2, 10 and 100 µg.L-1 ATZ tested caused a decrease in several sperm parameters, such as motility, mitochondrial functionality and membrane integrity, in relation to the control group, but there was no effect on DNA integrity. Repression of expression of genes related spermatogenesis (SRD5A2 and CFTR) and cellular protection (SOD2, GPX, XPC) in gonads of groups exposed to ATZ suggest the involvement of ATZ in gametogenic and protection pathways in the gonad, and may be one of the possible causes for the reduction of sperm quality. In liver, ATZ activated expression of detoxification and antioxidant genes (CYP1A, GSTP and SOD2). Transcription factors such as AHR and NF-B may be activate by the presence of ATZ and its oxidative products, and may represent possible mechanisms of transcriptional regulation involved in these responses. In summary, the present study suggests that the biotransformation capacity of ATZ via GST is species-specific, organ-specific and higher in fish that inhabit a contaminated environment. It also suggests that environmentally relevant concentrations of ATZ cause significant reproductive effects in male fish, and that these effects may be associated with the transcriptional regulation of key genes associated with spermatogenesis and cell protection.
