Vias de defesa celular da linhagem de hepatócitos do peixe Danio rerio (ZF-L) expostas ao herbicida glifosato e Roundup® Original

Abstract

Proteínas de membrana da família ATP-Binding Cassette (ABC) realizam o efluxo de diversas substâncias para fora da célula, conferindo o fenótipo de resistência a multixenobióticos, e contribuindo para a sobrevivência de organismos aquáticos em ambientes contaminados. A família de proteínas ABC possui 41 isoformas descritas para o peixe Danio rerio, sendo as subfamílias ABCB e ABCC importantes na eliminação de xenobióticos. Dentre os contaminantes ambientais o glifosato tem sido de grande destaque, por ser o princípio ativo dos herbicidas mais utilizados no mundo. No presente estudo foram avaliados os efeitos do glifosato e do Roundup® Original na linhagem de hepatócitos do peixe Danio rerio (ZF-L) sobre o mecanismo de resistência a xenobióticos. Foram realizados ensaios de citotoxicidade e viabilidade celular, quantificação de mitocôndrias ativas, atividade da enzima glutationa-S-transferase (GST), expressão gênica e proteica de membros da família ABC assim como a atividade dessas bombas, após exposição de 650 e 3250 µg/L de glifosato ou Roundup® por 24 e 48 horas. Além disso, foi realizada uma análise de Docking molecular do glifosato com as proteínas ABCB4 isoforma 1 e ABCC2. Os resultados mostraram que ambas exposições ao glifosato e Roundup® foram capazes de aumentar o percentual de mitocôndrias ativas, diminuir a atividade da GST e induzir apoptose. Enquanto que 3250 µg/L de Roundup® reduziu a atividade metabólica, integridade lisossomal e levou a morte celular por necrose. O glifosato é capaz de interagir com ambas proteínas ABCB4 isoforma 1 e ABCC2 de modo similar ao verapamil, sugerindo ser um possível substrato. A atividade das bombas ABC foi induzida em 48 horas após exposição a 650 µg/L de Roundup® e apesar da indução gênica, somente membros da subfamília ABCB aumentaram sua expressão proteica. E com isso concluímos que o glifosato puro foi tão danoso para a linhagem ZF-L quanto a formulação comercial Roundup®.

Membrane proteins from the ATP-Binding Cassette family (ABC) performs the efflux of several substances out of the cell, conferring the multixenobiotics resistance phenotype and contributing to the survival of aquatic organisms in contaminated environments. The ABC protein family has 41 isoforms described for Danio rerio, the ABCB and ABCC subfamilies are the most important in the xenobiotics elimination. Among the environmental contaminants, glyphosate has been of great importance, since it is the active ingredient of the most used herbicides in the world. In the present study, the effects of glyphosate and Original Roundup® on the hepatocyte cell line of Danio rerio (ZF-L) on the xenobiotic resistance mechanism were evaluated. Were performed cytotoxicity and cell viability assays, active mitochondria quantification, glutathione-S-transferase (GST) enzyme activity, gene and protein expression of members of the ABC family as well as the activity of these pumps were performed after 24 and 48 hours of exposure to 650 and 3250 µg/L of glyphosate or Roundup®. In addition, a molecular docking analysis of glyphosate was performed with the ABCB4 isoform 1 and ABCC2 proteins. The results showed that exposures to glyphosate and Roundup® were able to increase the percentage of active mitochondria, decrease the activity of the GST enzyme and induce apoptosis. While a lower metabolic activity, lower lysosomal integrity and necrotic cell death were observed only after exposure to a higher concentration of Roundup®. Glyphosate is able of interacting with both ABCB4 isoform 1 and ABCC2 proteins similarly to verapamil, suggesting that it is a possible substrate. ABC pump activity was induced only in the exposure to 650 µg/L of Roundup® at 48 hours, and, despite the gene induction, only members of the ABCB subfamily increased their protein expression. Therefore, conclude that pure glyphosate was as harmful to the ZF-L line as the Roundup® commercial formulation.