Caracterização do consócio de bactérias nitrificantes pelo método fish (Fluorescent in situ Hybrization) no biofilem e água de sistemas de cultivo do camarão-rosa Farfantepenaeus paulensis

Abstract

Uma das principais preocupações em sistemas de cultivo é o acúmulo de produtos nitrogenados, especialmente amônia (NH4). A troca de água de tanques, bem como a adição de fitoplâncton, são algumas das técnicas empregadas para se reduzir o nível de amônia nos sistemas de cultivo. Outra possibilidade seria a adição de bactérias nitrificantes como probióticos. Entretanto é necessário que esses microorganismos sejam obtidos da própria microbiota presente nos tanques para que não haja qualquer problema devido à adição de um organismo exótico. Devido a limitações técnicas, a identificação e isolamento de bactérias em ambientes de cultivo, como na natureza era sempre feita em pequena escala e em laboratórios especializados. Com o avanço de técnicas de biologia molecular é possível identificar grupos filogenéticos, determinar a variação espacial e temporal de espécies de microorganismos e elucidar função e atividade de comunidades coletadas do ambiente. Com o objetivo de estabelecer aspectos da sucessão bacteriana em tanques de cultivo através de técnicas de biologia molecular e relacionar a presença de bactérias nitrificantes no biofilme e na água foi utilizado neste estudo o método FISH (Fluorescent in situ hybridization). Este método é baseado na hibridização com marcadores fluorescentes de segmentos do rRNA 16S que demarcam grupos específicos de bactérias. Foram utilizadas as sondas -, - e - proteobactérias, que contempla a maioria das bactérias nitrificantes. Os experimentos foram conduzidos na Estação Marinha de Aqüicultura – EMA/FURG, no período de novembro de 2002 a fevereiro de 2003, nas fases de larvicultura e berçário do camarão– rosa Farfantepenaeus paulensis. Foi adicionado aos tanques substrato artificial para formação de biofilme, que eram coletados diariamente para análise da composição da assembléia de bactérias e clorofila a. Amostras de água eram coletadas para análise de amônia, nitrito e nitrato, além de dados de abundância de bactérias. No experimento na larvicultura foi observada a maior concentração de amônia na água, que atingiu 413,98 µM no tempo 2, diminuindo para 73,92µM no tempo seguinte. Os grupos - e - proteobactérias estiveram mais relacionados com a variação da amônia nos tanques e, através do balanço de massa de nitrogênio na larvicultura, foi possível verificar que a maior absorção de nitrogênio dos tanques ocorreu devido a nitrificação (22,3%). No segundo experimento (berçário) foi possível avaliar o impacto da predação do camarão sobre o biofilme, observando-se um efeito positivo sobre as microalgas quanto sobre as 2 bactérias do biofilme, isto é, a maior abundância de bactérias foi obtida em substratos sujeitos à predação do camarão, assim como a maior concentração de clorofila a. A concentração de compostos nitrogenados influenciou a composição da assembléia de bactérias no biofilme e na água, principalmente com a predominância de bactérias dos grupos - e -proteobactérias, relacionadas com a variação da amônia, enquanto que bactérias do grupo -proteobactéria estiveram relacionadas com a variação de nitrito.

One of the main concerns in culture systems is the accumulation of nitrogen products, especially ammonium (NH4). Water exchange, as well as, the addition of phytoplankton are the main techniques used to reduce the ammonium levels in the culture systems. Other possibility would be the accretion of nitrifying bacteria as probiotics. However, it is necessary that these microorganisms are obtained from the tanks microbiota, to avoid problems due to the introduction of exotic microorganisms. Due to technical limitation, the identification and isolation of bacteria from raising environment, as well as from nature, was always conducted in small scale at specialized laboratories. With the progress of molecular biology techniques it is possible to identify phylogenetic groups, to determine the space and time variation of species and to elucidate function and activity of microorganisms present in environmental samples. With the objective to identify the aspects of the bacterial succession in culture tanks through molecular biology techniques and to relate the presence of nitrifying bacteria in the biofilm and in the water, the FISH (Fluorescent in situ hybridization) method was used. It is based on the hybridization of fluorescent probes of 16S-rRNA that mark specific groups of bacteria. The probes -, - and -proteobactérias probes were used. The experiments were conducted in the Aquaculture Marine Station - EMA/FURG, in the period of November of 2002 to February of 2003, in the hatchery and nursery phases of the pinkshrimp Farfantepenaeus paulensis raising. Artificial substrates were added to the tanks for biofilm formation, and were daily collected and analyzed for the composition of the bacterial assemblage and chlorophyll a. Water samples were also daily collected for analysis of ammonium, nitrite and nitrate, besides data of bacterial abundance. In the hatchery experiment the largest concentration of ammonia was measured in the water, reaching 413,98 µM on the 2 time and decreasing to 73,92µM in the following time. The - and -proteobactérias groups were better related with the ammonium variation in the tanks, and through the nitrogen mass balance in the hatchery it was possible to verify that the largest uptake of nitrogen of the tanks was through nitrification (22,3%). In the second experiment (nursery) it was possible to evaluate the impact of the shrimp grazing on the biofilm, generating a positive effect on microalgae as on bacteria present in the biofilm. Larger abundance of bacteria was obtained in substrate to the shrimp grazing, similarly to the chlorophyll a concentration. The concentration of nitrogen 4 compounds influenced the composition of the assemblage of bacteria in the biofilm and in the water with the predominance of - and -proteobacteria groups, related to the ammonium variation, while the -proteobacteria were related to the nitrite variation.