Caracterização de enzimas digestórias do linguado (Paralichthys orbignyanus)

Abstract

Na Europa e na Ásia são produzidas três espécies conhecidas como linguado (Psetta máxima, Paralichthys olivaceus e Cynoglossus semilaevis). No Brasil não existe produção comercial de linguado, no entanto a principal espécie alvo dos estudos é o Paralichthys orbignyanus. Esta espécie já foi um recurso pesqueiro importante no sul do país, no entanto, a pesca encontra-se estagnada. Assim, a produção deste linguado pode ser uma alternativa para aumentar a oferta de pescado na região, devido às características que apontam a viabilidade de criação como tolerância às concentrações elevadas de compostos nitrogenados, variações de temperatura, bom crescimento em água salgada e salobra, reprodução e larvicultura em cativeiro dominadas. Entretanto, ainda existe uma grande carência de pesquisas relacionadas à fisiologia disgestória da espécie. Para isso foi determinada e caracterizada a atividade de enzimas digestórias presentes no fígado, intestino e estômago do linguado (Paralichthys orbignyanus), através de substratos inespecíficos e específicos, além de inibidores específicos. Os parâmetros físico-químicos também foram determinados utilizando substratos específicos. Para a análise das enzimas digestórias presentes no extrato bruto do intestino e fígado realizaram-se ensaios in vitro na presença dos substratos de cadeia longa (azocaseína 1% e amido 2%), p-nitroanilide (BApNA, SApNA e Leu-p-Nan). Para análise de enzimas digestórias presente no extrato bruto do estômago foi utilizado substrato hemoglobina. Para análise enzimática das aminopeptidases presentes no extrato bruto do intestino foi usado o substrato β- naphthylamide (alanina, arginina, leucina, prolina, tirosina, serina, glicina, isoleucina e histidina). Atividade enzimática presente no extrato bruto do intestino foi: Azocaseína (0,3645 ± 0,25mU mg-1 ), BApNA (0,5119 ± 0,2 mU mg-1 ), SApNA(2,6281 ± 1,8 mU mg-1 ), Leu-p-Nan (0,9709 ± 0,83 mU mg-1), amido (sem atividae). A atividade enzimática presente no extrato bruto do fígado: Azocaseína (0,27 ± 0,01mU mg-1), BApNA (0), 4 SApNA(0,7 ± 0,08 mU mg-1 ), Leu-p-Nan (0), amido (33,25 ± 0,8 mU mg-1).O efeito dos inibidores espécificos sobre a atividade residual das peptidases presentes no extrato bruto do intestino apresentou o seguinte perfil: PMSF (BapNA=52±2,3; SapNa=42±1,2; Leu-p- Nan= 43±1,4%), TLCK (BapNA=33±1,8; SapNa=45±0,3; Leu-p-Nan= 44±4,1%), TPCK (BapNA=100±1,2; SapNa=79±4,5; Leu-p-Nan= 60±1,8%), Benzamidina (BapNA=41±2,3; SapNa=58±0,5; Leu-p-Nan= 40±1,2%). Padrões de inibição peculiar podem ser explicados devido à utilização do extrato bruto que apresenta outras enzimas, além destes inibidores serem baseados em enzimas de mamíferos. O pH ótimo observado para a atividade de tripsina, quimotripsina, leucino aminopeptidase, amilase e pepsina foi pH 9,5, 9, 8, 7,5 e 3,5, respectivamente. A temperatura ótima observada para a atividade destas enzimas foi 50, 50, 50, 40 e 45°C, respectivamente. A Alanina e a Leucina aminopeptidases apresentaram uma alta atividade comparada à outras aminopeptidases avaliadas. A tripsina e leucino aminopeptidase demonstraram ser termoestáveis até 70 e 50°C, respectivamente. Características que indicam a possibilidade de aplicação biotecnológica.

In Europe and Asia three species known as flounder (Psetta maximum Paralichthys olivaceus and Cynoglossus semilaevis) are reared. In Brazil the flounder production is still incipient and is the main species found Paralichthys orbignyanus. This species was an important fishery resource in the South Brazil. However, fishing is stagnant. Thus, the production of this flounder in captivity can be an alternative to increase the supply of fish in the region, due to the characteristics that indicate the feasibility of creating such tolerance to high concentrations of nitrogen compounds, temperature variations, good growth in saltwater and brackish, and knowledge about reproduction and larviculture. However, there is still a lack of information related to the digestive physiology of the species. This dissertation investigated and characterized the digestive enzymes activities presented in liver; intestine and stomach of juvenile flounder (Paralichthys orbignyanus) through nonspecific and specific substrates, in addition to specific inhibitors. The physico- chemical parameters were determined using specific substrates. For the analysis of enzymes digestive present in the crude extract of the liver and intestine were performed in vitro in the presence of long chain substrates (1% azocasein 2% and starch), p-nitroanilide (BApNA, Sapna and Leu-p-Nan ). For analysis of enzymes present in the crude extract digestive stomach hemoglobin substrate was used. For enzymatic analysis of the aminopeptidase present in the crude extract was used intestine β-naphthylamide substrate (alanine, arginine, leucine, proline, tyrosine, serine, glycine, isoleucine and histidine). Enzyme activity present in the crude extract of the intestine was: azocasein (0.3645 ± 0.25 mU mg-1), BApNA (0.5119 ± 0.2 mU mg-1), Sapna (2.6281 ± 1.8 mU mg -1), Leu-p-Nan (0.9709 ± 0.83 mU mg-1), starch (0). Enzyme activity present in the crude extract of the liver: azocasein (0.27 ± 0.01 mU mg-1), BApNA (0), Sapna (0.7 ± 0.08 mU mg-1), Leu-p- Nan (0 ), starch (33.25 ± 0.8 mU mg-1). The effect of specific inhibitors on the residual 6 activity of peptidases present in the crude extract of the intestine showed the following profile: PMSF (BAPNA = 52 ± 2.3; Sapna = 42 ± 1.2;-Leu-Nan p = 43 ± 1, 4%), TLCK (BAPNA = 33 ± 1.8; Sapna = 45 ± 0.3, p-Leu-Nan = 44 ± 4.1%), TPCK (BAPNA = 100 ± 1.2; Sapna = 79 ± 4.5, Leu-p-Nan = 60 ± 1.8%), Benzamidine (BAPNA = 41 ± 2.3; Sapna = 58 ± 0.5, p-Leu-Nan = 40 ± 1.2%). The peculiar inhibition patterns can be explained by the use of crude extracts, which presents other enzymes, and these inhibitors are based on mammalian enzymes. The optimum pH observed for the activities of trypsin, chymotrypsin, leucino aminopeptidase, amylase and pepsin were pH 9.5, 9, 8, 7.5 and 3.5, respectively. The optimum temperatures for the observed activities of these enzymes were 50, 50, 50, 40 and 45 ° C respectively. Alanine and leucine aminopeptidase showed high activity compared to other aminopeptidases evaluated. Trypsin and leucine aminopeptidases showed to be thermostable up to 70 ° C and 50 respectively. Characteristics that indicate the possibility of biotechnological applications.