Sobrenadante de Lactobacillus acidophilus ATCC 4653: análise fisico-quimica e ação larvicida sobre Toxocara canis

Abstract

Introdução: A toxocaríase é uma antropozoonose parasitária negligenciada. Na busca por métodos de controle, estudos que avaliam o efeito de probióticos têm mostrado resultados promissores. A partir de estudo anterior realizado por nosso grupo de pesquisa, foi possível observar que o sobrenadante do probiótico Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 promoveu morte de 100% das larvas de Toxocara canis no teste in vitro. Assim, o presente estudo visou investigar características do sobrenadante de L. acidophilus ATCC 4356 que possam estar envolvidas no efeito larvicida sobre Toxocara canis. Materiais e Métodos: Considerando que o ácido lático está entre os principais metabólitos de L. acidophilus, inicialmente foi avaliado se a forma de cultivo interfere na concentração deste ácido orgânico no sobrenadante. Para tal, foram realizados diferentes cultivos de L. acidophilus ATCC 4356, com diferenças quanto ao meio de cultura, à temperatura e ao tempo de cultivo. O sobrenadante obtido foi filtrado e quantificado por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC). Foi também avaliada a concentração de ácido acético, por HPLC, o pH e os níveis de peróxido de hidrogênio, por volumetria de oxidorredução, no sobrenadante puro e em diluições seriadas (1:2 até 1:128). Para a avalição do efeito larvicida, larvas de T. canis foram cultivadas em meio RPMI 1640 juntamente com o sobrenadante puro ou diluído em placa de 96 poços, em triplicata. Como controle de larvas mortas foram utilizadas larvas congeladas a -20oC e submetidas a choque térmico à 60oC e, como controle de larvas vivas, foram usadas larvas cultivadas em meio MRS ou RPMI 1640. A placa foi incubada em estufa a 37ºC com 5-10% de CO2 por 48 horas e, após, foi adicionado o marcador de viabilidade celular azul de tripan, tendo sido realizada a leitura em microscópio óptico. Resultados: A forma de cultivo não alterou significativamente a concentração de ácido lático no sobrenadante, sendo observada uma concentração máxima de 19,1 g/L. Em relação ao ácido acético, foi observada uma concentração de 5,0 g/L no sobrenadante puro. Foi observado um pH ácido de 3,8 quando o sobrenadante foi avaliado puro, mantendo-se ácido nas diluições de 1:2 até 1:16. Quando avaliado nas diluições 1:32 até 1:128 o pH estava neutro. Em relação a análise dos níveis de peróxido de hidrogênio, o valor encontrado foi inferior a 14,0 mg/L na amostra do sobrenadante puro. No teste in vitro, mesmo após ser diluído 1:2, foi observada uma ação 100% larvicida do sobrenadante sobre Toxocara canis. Conclusões: A partir dos resultados obtidos, pode-se sugerir que a presença de concentrações mais elevadas de ácido lático e a acidez do sobrenadante puro e diluído 1:2 estão relacionados à ação larvicida sobre Toxocara canis. O sobrenadante L. acidophilus ATCC 4356 diluído 1:2 parece ser a melhor opção, uma vez que mantém as características de acidez e a ação larvicida.

Introduction: Toxocariasis is a neglected parasitic anthropozoonosis. In the search for control methods, studies that evaluated the effect of probiotics showed promising results. From the previous study carried out in our research group, it was possible to observe that the supernatant of the probiotic Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 promoted the death of 100% of the larvae of Toxocara canis not tested in vitro. Thus, the present study aims to investigate characteristics of the supernatant of L. acidophilus ATCC 4356 that may be involved in the larvicidal effect on Toxocara canis. Materials and Methods: Considering that lactic acid is among the main metabolites of L. acidophilus, it was initially evaluated whether the culture method interferes with the concentration of this organic acid in the supernatant. For this purpose, different cultivations of L. acidophilus ATCC 4356 were carried out, with differences in culture medium, temperature and cultivation time. The supernatant obtained was filtered and quantified by high performance liquid chromatography (HPLC). The concentration of acetic acid, by HPLC, the pH and the levels of hydrogen peroxide, by redox volumetry, in the pure supernatant and in serial dilutions (1:2 to 1:128) were also evaluated. To evaluate the larvicidal effect, T. canis larvae were cultured in RPMI 1640 medium together with the pure or diluted supernatant in 96-well plates, in triplicate. As a control of dead larvae, larvae frozen at - 20oC and kept in thermal shock at 60oC were used, and as a control of live larvae, larvae cultivated in MRS or RPMI 1640 medium were used. The plate was incubated in an oven at 37ºC with 5-10% of CO2 for 48 hours and then trypan blue cell viability marker was added and read under an optical microscope. Results: The culture method did not significantly alter the lactic acid concentration in the supernatant, with a maximum concentration of 19.1 g/L being observed. Regarding acetic acid, a concentration of 5.0 g/L was observed in the pure supernatant. An acidic pH of 3.8 was observed when the supernatant was evaluated neat, remaining acidic at dilutions from 1:2 to 1:16. When we evaluated the dilutions from 1:32 to 1:128, the pH was neutral. Regarding the analysis of hydrogen peroxide levels, the value found was less than 14.0 mg/L in the pure supernatant sample. No in vitro test, even after being diluted 1:2, a 100% larvicidal action of the supernatant on Toxocara canis was observed. Conclusions: From the results obtained, it can be suggested that the presence of higher concentrations of lactic acid and the acidity of the pure and diluted 1:2 supernatant are related to the larvicidal action on Toxocara canis. The L. acidophilus ATCC 4356 supernatant diluted 1:2 seems to be the best option, since it maintains acidity characteristics and larvicidal action.