Kalil, Susana JulianoSouza, Nathiéli Bastos de2025-04-072025-04-072020SOUZA, Nathiéli Bastos de. Maximização da produção de endo-β-1,4-xilanase por Aureobasidium pullulans CCT 1261 e aplicação do extrato enzimático na síntese de xilo-oligossacarídeos e clarificação de suco. 2020. 103 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia e Ciência de Alimentos) - Programa de Pós-graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande, 2020.https://repositorio.furg.br/handle/123456789/12624Dissertação (Mestrado)Endo-β-1,4-xilanases são enzimas capazes de hidrolisar a cadeia da xilana e produzir xilooligossacarídeos (XOs), que apresentam uma ampla gama de aplicações industriais. A maximização da produção de endo-β-1,4-xilanases por micro-organismos pode reduzir custos e fornecer uma enzima com alta capacidade catalítica, para aplicação no processo de clarificação de sucos e produção de XOs. Esse estudo teve como objetivo, maximizar a produção de endo-β-1,4-xilanases por Aureobasidium pullulans CCT 1261 utilizando casca de aveia pré-tratada como fonte de xilana, bem como a caracterização e aplicação da enzima na síntese de XOs e clarificação de suco de laranja. Primeiramente, os pré-tratamentos alcalinos e de ultrassom foram aplicados na casca de aveia, após, foi utilizada como substrato na produção de enzimas, realizada em frascos Erlenmeyer com 150 mL de meio de cultura e 2% de inóculo da levedura, incubados a 28 ºC por 120 h. A maximização da produção da endo-β-1,4-xilanase, foi realizada por Delineamento Composto Central (DCC) 24 , e os efeitos do pH (3,0-7,0), concentrações de casca de aveia pré-tratada (10-50 g/L), extrato de levedura (0,5-1,5 g/L) e KH2PO4 (0-5 g/L) foram avaliados. A atividade da endo-β-1,4-xilanase, proteínas solúveis e pH, foram medidas durante o tempo de cultivo. O efeito das ondas ultrassônicas sobre a atividade enzimática quando aplicada no extrato enzimático bruto e na xilana de madeira de faia foram avaliados, utilizando uma frequência de 20 kHz e intensidade de 0,5 a 7 W/mL, durante o período de 1, 3 e 5 min. A precipitação fracionada de sal com sulfato de amônia (0- 30%/30-60%) foi aplicado para purificação do extrato enzimático. Também foram determinados temperatura e pH ótimos, parâmetros cinéticos (Km e Vmax) e estabilidade térmica para o extrato enzimático bruto. Posteriormente a endo-β-1,4-xilanase foi aplicada na hidrólise enzimática de xilana de madeira de faia e na clarificação de suco de laranja. A produção máxima da xilanase foi obtida utilizando 50 g/L de casca de aveia pré-tratada, pH 3,0, 1,5 g/L de extrato de levedura e 5,0 g/L de KH2PO4. Após os ensaios de maximização, a atividade da endo-β-1,4- xilanase foi 6,37 vezes maior que no ensaio controle. A aplicação de ondas ultrassônicas no extrato enzimático bruto (1 W/mL por 3 min) e na xilana de madeira de faia (5 W/mL por 5 min) melhorou a atividade da endo-β-1,4-xilanase em 4,3% e 16,6%, respectivamente. A purificação enzimática pela precipitação de sal não foi possível. Quanto à caracterização do extrato bruto, observou-se uma faixa de temperatura e pH ótimos de 45 a 50 ºC e 5,0, respectivamente. A meia vida a 40 ºC foi determinada em 11 dias e valor z 4,63 ºC. O extrato enzimático bruto apresentou Vmax de 2000 U/mL e Km de 69,8 mg/mL. Durante a clarificação do suco de laranja com aplicação de endo-β-1,4-xilanase bruta, observou-se um aumento 28,3% na claridade e 5,9% do teor de açúcares redutores e redução de 23,9% na turbidez. Por aplicação do extrato enzimático bruto na hidrólise da xilana, foi observada uma concentração final de 12,9 mg/mL de XOs totais com 24 h de processo. Além disso, o uso de xilana de madeira de faia pré-tratada por ultrassom, aumentou a concentração de oligômeros em 20%. Concluindo com o estudo, que foi possível a maximização da produção de endo-β-1,4-xilanase, a caracterização do extrato enzimático bruto e a aplicação eficiente da enzima em processos de produção de XOs e clarificação de suco de laranja.Endo-β-1,4-xylanase are enzymes capable of hydrolyzing the xylan chain and produce xylooligosaccharides (XOs), while they have a wide range of industrial applications. Maximization of endo-β-1,4-xylanase production by microorganisms can reduce costs and provide an enzyme with high catalytic capacity for application in processes such as juice clarification and XOs production. This study aimed to maximize the endoxylanase production by Aureobasidium pullulans CCT 1261 using pretreated oat hulls as xylan source, as well as the enzyme characterization and application in XOs synthesis and juice clarification. Firstly, the alkaline and ultrasound pretreatments were applied on the oat hull; then, it was used as substrate in the enzyme production, which was performed in Erlenmeyer flasks containing 150 mL of culture medium and 2% of yeast inoculum. Maximization of endoxylanase production was performed by a 24 Central Composite Design, and the effects of pH (3.0-7.0) and concentrations of pretreated oat hull (10-50 g/L), yeast extract (0.5-1.5 g/L), and potassium phosphate (KH2PO4) (0-5 g/L) were evaluated. Endo-β-1,4-xylanase activity, soluble proteins and pH were measured during the cultivation time. The effect of ultrasonic waves on the enzymatic extract and beechwood xylan was evaluated using a frequency of 20 kHz and intensity of 0.5 to 7 W/mL during the period of 1, 3 and 5 min. Fractioned salt precipitation with ammonium sulfate (0-30%/30-60%) was applied to purify the enzyme extract. Optimum temperature and pH, kinetic parameters (Km and Vmax) and thermal stability for the crude enzymatic extract were also determined. Posteriorly, the endoxylanase was applied in the hydrolysis of beechwood xylan and in the orange juice clarification. Maximum xylanase production was obtained using 5.0 g/L of KH2PO4, 1.5 g/L of yeast extract, 50 g/L of pretreated oat hulls and pH 3.0. After the maximization assays, endoxylanase activity was 6.37 times higher than in the control trial. The application of ultrasonic waves in the crude enzymatic extract (1 W/mL for 3 min) and in the beechwood xylan (5 W/mL for 5 min) improved the endoxylanase activity in 4.3% and 16.6%, respectively. The enzyme purification by the salt precipitation was not possible to achieve. Regarding the characterization of the crude extract, it was observed an optimal temperature and pH of 45 to 50 ºC and 5.0, respectively. The half-life at 40 ºC was determined as 11 days and z-value as 4.63 ºC. Crude enzymatic extract exhibited Vmax of 2000 U/mL and Km of 69.8 mg/mL. During the orange juice clarification using the crude extract, it was observed an increase of 28.3% and 5.9% in clarity and in the reducing sugar content, respectively, and a reduction of 23.9% in turbidity. By application of the crude extract in xylan hydrolysis, it was observed a final concentration of 12.9 mg/mL of XOs in 24 h of reaction. Furthermore, the use of pretreated xylan by ultrasound in XOs production improved the oligomers concentration in 20%. In conclusion, this study enabled the maximization of endoxylanase production, the characterization of the crude extract, and the efficient application of enzymes in processes related to the food industry.poropen accessMaterial lignocelulósicoLeveduraEndo-β-1,4-xilanaseOligossacarídeosClarificação de sucosLignocellulosic MaterialYeastEndo-β-1,4-xylanaseOligosaccharidesJuice clarificationmasterThesis