Abstract:
The method used by YAGYU et al. for the subtype-specific polymerase chain reaction (PCR) amplification of the gp41
transmembrane region of the human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) env gene, was tested. HIV-1 proviral DNA from 100
infected individuals in Itajaí, South Brazil was used to analyze this method. Seventy individuals were determined according to this
method as having PCR products at the expected size for subtypes B, C, D and F. Of these individuals, 26 (37.1%) were observed as
having the expected amplification for subtype C, and 42 (60%) were observed as having the expected products for subtypes B and
D. Of the subtype B and D amplicons, 16 (22.9%) were classified as subtype D, and 26 (37.1%) were classified as subtype B. Two
individuals (2.9%) had amplicons that were observed after subtype F-specific amplification was performed. Sequencing and comparing
the patient sequences to reference sequences confirmed the classification of sequences of subtypes C and B. However, sequences that
were falsely determined as being D and F in the PCR assay were determined as being subtypes C and B, respectively, by sequence
analysis. For those individuals from whom no amplified products were obtained, a low viral load that was indicated in their patient
history may explain the difficulty in subtyping by PCR methods. This issue was demonstrated by the results of ANOVA when testing
the effect of viral load on the success of PCR amplification. The alignment of the obtained sequences with HIV-1 reference sequences
demonstrated that there is high intra-subtype diversity. This indicates that the subtype-specific primer binding sites were not conserved
or representative of the subtypes that are observed in the Brazilian populations, and that they did not allow the correct classification of
HIV-1 subtypes. Therefore, the proposed method by YAGYU et al. is not applicable for the classification of Brazilian HIV-1 subtypes.
A metodologia para amplificação subtipo-específica por PCR da
região transmembrana do gene env (gp41) do HIV-1, descrita por Yagyu
e colaboradores, foi testada a partir de DNA proviral de 100 pacientes
infectados pelo HIV-1 de Itajaí, Sul do Brasil. Setenta indivíduos
apresentaram produtos amplificados e correspondentes aos subtipos B,
C, D e F de acordo com a metodologia escolhida. Destes indivíduos, 26
(37,1%) apresentaram a amplificação esperada para o subtipo C de acordo
com a metodologia; 42 (60%) apresentaram os produtos esperados para
os subtipos B e D, sendo que na etapa seguinte de diferenciação destes
subtipos, 16 (22,9%) corresponderam ao subtipo D e 26 (37,1%) ao
subtipo B. Dois indivíduos (2,9%) mostraram produtos amplificados após a
amplificação específica para o subtipo F. O sequenciamento e a comparação
com sequências referências confirmou a subtipagem de HIV-1 C e B obtida
pela metodologia. No entanto, indivíduos subtipados erroneamente como
HIV-1 D e F pela metodologia, foram classificados pela comparação com
sequências referências como subtipos C e B, respectivamente. Em relação
aos indivíduos que não mostraram produtos amplificados, a baixa carga
viral observada no histórico destes pacientes seria em parte responsável pela
dificuldade na subtipagem pela metodologia de PCR, como demonstrado
pelo resultado significativo no ANOVA ao testar o efeito da carga viral
no sucesso da amplificação. O alinhamento das sequências obtidas com
sequências referências de HIV-1 correspondentes à região da gp41
demonstrou que há uma alta diversidade intra-subtipo e que as regiões
a partir das quais foram desenhados os oligonucleotídeos iniciadores
HIV-1 subtipo-específicos não são conservadas nem suficientemente
representativas dos subtipos observados nas populações brasileiras para
permitir sua correta identificação. Portanto, esta metodologia não é
aplicável para populações virais brasileiras.
