Abstract:
O objetivo deste trabalho foi produzir linhagens germinativas transgênicas do
paulistinha (Danio rerio) para o gene do hormônio do crescimento (GH) através da
técnica de co-injeção utilizando o gene marcador da proteína verde fluorescente (GFP).
Para atingir este objetivo, na primeira parte deste trabalho foram determinadas as
condições a serem utilizadas para a produção dos peixes transgênicos. Para isto, foram
microinjetadas em ovos recém fertilizados, duas concentrações diferentes da construção
genética contendo o gene da GFP associado ao promotor da -actina da carpa (Cyprinus
carpio). Os resultados obtidos demonstraram que a concentração de 18,3 ng/L foi mais
eficiente na produção de indivíduos transgênicos em relação à concentração de 3,7
ng/L. Na segunda parte deste estudo, foi utilizada a estratégia de co-injeção do gene do
GH com o gene marcador para avaliar o grau de mosaicismo in vivo e identificar
paulistinhas transgênicos com potencial para gerar linhagens germinativas para o gene
de interesse. As duas construções, reguladas pelo mesmo promotor, foram co-injetadas
linearizadas numa proporção equimolar (1:1). O gene do GH utilizado foi o do peixe
rei-marinho Odonthestes argentinensis (msGH). Após a eclosão, as larvas foram
observadas em microscópio de epifluorescência, e as que apresentaram uma expressão
forte para a GFP foram cultivadas até a maturidade sexual, quando foram reproduzidas
com indivíduos não-transgênicos. Os peixes G1 positivos para a expressão da GFP
foram analisados por PCR de DNA genômico para a presença do gene do msGH. Isto
permitiu identificar dois indivíduos G0 (M0104 e F0104) que transmitiram os dois
transgenes para a G1. Os animais da G1 que carregavam ambos transgenes foram
reproduzidos com não-transgênicos. A análise da G2 demonstrou que na linhagem
M0104 os transgenes integraram-se em cromossomos diferentes, e que na linhagem
F0104 os dois transgenes integraram-se no mesmo cromossomo. Na terceira parte deste
trabalho, foram realizados experimentos de crescimento entre transgênicos
homozigotos, hemizigotos e não-transgênicos da linhagem F0104. Os resultados destes
experimentos demonstraram que os animais hemizigotos apresentaram um crescimento
significativamente maior do que os demais, o que pode ser explicado pelo aumento
significativo da expressão do gene do IGF-I (Fator de crescimento tipo-insulina I)
observado nesta classe. Embora os transgênicos homozigotos tenham apresentado,
vii
como esperado, uma maior expressão do gene do msGH, não foi detectada a expressão
do gene do IGF-I. Este fato pode explicar os resultados dos experimentos de
crescimento. A metodologia aplicada no presente estudo permitiu inferências sobre os
eventos de integração dos transgenes utilizados, possibilitando a identificação de uma
linhagem que estava transmitindo ambos transgenes ligados no mesmo cromossomo. No
modelo experimental aqui desenvolvido, peixes transgênicos hemizigotos mostraram-se
mais viáveis para o cultivo. Estes resultados podem, no futuro, ser aplicados para a
produção de linhagens geneticamente modificadas de espécies de peixes
comercialmente importantes com maior performance de crescimento.
The objective of this work was to produce transgenic zebrafish germline (Danio
rerio) for the growth hormone (GH) gene using the of co-injection technique with the
green fluorescent protein (GFP) reporter gene. To reach this objective, in the first part of
this work were determined the conditions to be used for transgenic fish production. For
this, just fertilized eggs of zebrafish were microinjected with two different
concentrations of the genetic construction, containing the gene of the GFP associated
with the carp (Cyprinus carpio) -actin promoter. The obtained results demonstrated
that the concentration of 18.3 ng/L was more efficient in the production of transgenic
individuals in relation to the concentration of 3.7 ng/L. In the second part of this study,
it was used the co-injection strategy of the GH gene along with the reporter gene to
evaluate the mosaicism degree in vivo and to identify transgenic zebrafish with potential
to generate germline for gene of interest. The two constructions were regulated by the
same promoter and co-injected linearized in a equimolar ratio (1:1). The GH gene used
was from the marine silverside Odonthestes argentinensis (msGH). After the hatching,
the larvae were observed in epifluorescence microscope, G0 transgenic individuals
classified as strong for GFP expression were cultivated until the sexual maturity, when
were reproduced with non-transgenic individuals. The G1 fish positive for the GFP
expression were analyzed by PCR of genomic DNA for the presence of the msGH gene.
This allowed identifying two G0 individuals (M0104 and F0104) that were transmitting
both transgenes for the G1. The G1 animals positive to both transgenes were reproduced
with non-transgenic. The G2 individuals originated from the M0104 lineage, when
analyzed for both transgenes indicated that the integration occurred in different
chromosomes, and in the F0104 lineage the two transgenes had integrated in the same
chromosome. In the third part of this work, growth experiments were carried out
comparing transgenic homozygous, hemizygous and non-transgenic produced from
F0104 lineage. The results of these experiments demonstrated that the hemizygous
individuals presented a significantly bigger growth than the other classes, which can be
explained by the significative increased expression of the IGF-I (Insulin-like growth
factor) gene in this class. Even though transgenic homozygous had presented, as
expected, bigger expression of the msGH gene than hemizygous fish, no expression for
ix
IGF-I gene was observed. This fact can explain the growth experiments results. The
methodology applied in the present study allowed inferences about the integration
events of transgenes used, making possible the identification of a lineage that was
carrying both transgenes in the same chromosome. In the experimental model here
developed, transgenic hemizygous fish showed to be more viable to culture. These
results can be, in the future, applied for genetically modified lineage production of
comercialy important fish species with improved growth performance.
