Abstract:
Os estudos descritos nesta Tese envolvem a aplicação de métodos para o
desenvolvimento da tecnologia do RNAi direcionada a terapia gênica de camarões L.
vannamei infectados com o vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV) e ao estudo da
reprodução do L. vannamei através do silenciamento pós-transcricional do gene que
codifica para hormônio inibidor dos gônadas (GIH). No Capítulo I, metodologias para
a detecção e quantificação por RT-qPCR e qPCR dos vírus da Mionecrose Infecciosa
(IMNV) e do vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV), respectivamente, foram
desenvolvidas e efetivas para a detecção inédita da ocorrência da co-infecção com
ambos os vírus em espécimes do camarão L. vannamei. No Capítulo II foi demostrado
que o padrão de transcrição dos principais genes chaves do mecanismo de RNAi (Sid-1,
Dicer-2 e Argonauta-2) do L. vannamei não é afetado pela infecção causada pelo IMNV
quando da injeção de diferentes concentrações do inóculo viral e que o número médio
de 2,55 x 103 cópias do IMNV detectados em tecido hemocítico pode ser considerado
seguro para os sistemas de cultivos de L. vannamei sob condições ótimas. O Capítulo
III descreve a produção de moléculas de dsRNA relacionadas a diferentes ORFs do
genoma do IMNV (dsRNA-IMNV ORF1a, dsRNA-IMNV ORF1b ou dsRNA-IMNV
ORF2) para a terapia de camarões L. vannamei infectados experimentalmente com 1,02
x 106 cópias do IMNV. Os tratamentos com as dsRNA-IMNV (ORF1a) e dsRNA-
IMNV (ORF1b) se mostraram efetivos na inibição da replicação do IMNV resultando
em sobrevivências de 90% e 80%, respectivamente, após 34 dias de desafio
experimental. Os resultados obtidos neste capítulo sugerem uma exportação do sinal do
RNAi pelo canal de transmembrana SID-1, sendo este evento diretamente associado à
inibição da replicação do IMNV e, consequentemente, com a sobrevivência dos
camarões desafiados. No Capítulo IV foi demostrado que apesar do “knockdown” dos
níveis do mRNA do GIH detectados no pedúnculo ocular das fêmeas de L. vannamei
injetadas com as dsRNA-GIH, o efeito sobre a expressão do mRNA da vitelogenina nos
ovários e no diâmetro dos oócitos somente foi verificado no 37° dia pós injeção. Os
resultado apresentados na presente tese confirmam o potencial da utilização da
tecnologia do RNAi tanto para a terapia gênica de enfermidade virais como para o
estudo da reprodução em camarões L.vannamei.
The studies described in this Thesis involve the application of methods for the
development of RNAi technology for gene therapy of the shrimp L. vannamei infected
with the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) and to study the reproduction of L.
vannamei through the post-transcriptional silencing of the gene that encodes for the
Gonadal Inhibitor Hormone (GIH). In Chapter I, methodologies for the detection and
quantification by RT-qPCR and qPCR of the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) and
the White Spot Syndrome Virus (WSSV), respectively, were developed and effective for
the first detection of the occurrence of co-infection with both viruses in specimens of
the shrimp L. vannamei. In Chapter II it was shown that the pattern of transcription of
the main key-genes of RNAi (Sid-1, Dicer-2 and Argonauta-2) of L. vannamei is not
affected by infection caused by IMNV when injecting different concentrations of viral
inoculum and that the average number of 2.55 x 103 copies of IMNV detected in
haemocytic tissue can be considered safe for farming systems of L. vannamei under
optimal conditions. Chapter III describes the production of dsRNA molecules related
to different ORFs of IMNV genome (dsRNA-IMNV ORF1a, dsRNA-IMNV ORF1b or
dsRNA-IMNV ORF2) for therapy of L. vannamei experimentally infected with 1.02 x
106 copies of IMNV. The treatments with the dsRNA-IMNV (ORF1a) and dsRNA-
IMNV (ORF1b) were effective in inhibiting the IMNV replication resulting in survival
of 90% and 80%, respectively, after 34 days of experimental challenge. The results of
this chapter suggest an export signal of RNAi by the SID-1 transmembrane channel,
being this event directly related to the inhibition of the replication of the IMNV and,
consequently, the survival of the challenged shrimps. In Chapter IV it was
demonstrated that although the "knockdown" of the mRNA of the GIH levels detected
in eyestalk of L. vannamei females injected with the dsRNA-GIH, the effect on mRNA
expression of the vitellogenin in ovaries and in oocytes diameter, was only verified in
the 37th day post-injection. The results presented in this thesis confirm the potential of
the use of RNAi technology for both gene therapy of viral infirmities as well as for the
study of reproduction in shrimps L.vannamei.
