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Aplicação de carboxipeptidase obtida de Rhizopus na degradação de ocratoxina A
(2013) Kupski, Larine; Alves, Chiara Leal; Buffon, Jaqueline Garda; Furlong, Eliana Badiale
Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos filamentosos em diferentes etapas da cadeia produtiva de alimentos. Entre micotoxinas, ocratoxina A (OTA) é de grande importância, e apresenta efeitos carcinogênicos, nefrotóxicos e teratogênicos. Estes efeitos vêm motivando o desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação aos níveis permitidos pela legislação. Os métodos biológicos envolvendo o uso de enzimas e microorganismos para degradação da OTA tem se destacado, em função da especificidade reacional e das condições brandas para a detoxificação. Neste trabalho foram estabelecidas condições de extração de carboxipeptidase A a partir de biomassa fermentada por Rhizopus oryzae para empregá-la na degradação de OTA, tendo pancreatina como controle. A metodologia padronizada para extração enzimática consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40kHz. O extrato enzimático do microorganismo apresentou uma capacidade de degradação de 19,4%, que ocasionou uma degradação 49% superior a ação da pancreatina. Este resultado confirma a vantagem da utilização de enzimas microbianas em detrimento as de origem vegetal inclusive para processos de biodegradação micotoxicologica.
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Application of protein-phenolic based coating on tomatoes (Lycopersicum esculentum)
(2012) Cipolatti, Eliane Pereira; Kupski, Larine; Rocha, Meritaine da; Oliveira, Melissa dos Santos; Buffon, Jaqueline Garda; Furlong, Eliana Badiale
The aim of this study was to investigate the use of protein-phenolic based coating made from fermented rice bran on cherry tomatoes (Lycopersicum esculentum). Tests were performed with glycerol 3% (v/v), glycerol with protein-phenolic rice bran extract (5%), glycerol with protein-phenolic extract after 96 hours of fermentation (5%), and a control (without coating). The coated cherry tomatoes were kept at room temperature for 28 days. Mass loss, pH and acidity, total soluble solids, and carotenoids were determined every 96 hours. The coating made from the biomass extract reduced the carotenoid and acidity levels in the fruits studied by 17 and 21.1%, respectively, compared to the control. The coating proved an efficient barrier to water vapor with mass loss of 57% less than the control suggesting that it can be used as an alternative for vegetable tissue conservation.
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Changes in lipid, fatty acids and phospholipids composition of whole rice bran after solid-state fungal fermentation
(2011) Oliveira, Melissa dos Santos; Feddern, Vivian; Kupski, Larine; Cipolatti, Eliane Pereira; Furlong, Eliana Badiale; Soares, Leonor Almeida de Souza
The aim of this study was to evaluate fermented rice bran phospholipids, lipids and fatty acid content in a fermentation solid system with Rhizopus oryzae fungus. For this, aliquots were withdrawn every 24 h over 120 h. The content of phospholipids was determined by colorimetric method.Esterified fatty acids were separated by gas chromatography, then identified and quantified. The total lipids from fermented rice bran (FB) decreased from 20.4% to 11.2% in the range between 0 h and 120 h of fermentation while phospholipid contents were increased up to 2:4 mg P g 1 lipid . In fermented bran, oleic, palmitic and linoleic acids prevailed, with a decrease in saturated fatty acids (20%) and increase in the unsaturated ones (5%). This study showed that rice bran fermentation with R. oryzae can be applied to the production of phospholipids altering the saturated to unsaturated fatty acid ratio.
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Degradação de Ocratoxina a: estudo de processo e toxicidade
(2015) Kupski, Larine; Furlong, Eliana Badiale
A ocratoxina A (OTA), micotoxina encontrada em diferentes níveis e em diversas matrizes, apresenta efeitos carcinogênicos, nefrotóxicos e teratogênicos. O desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação a níveis permitidos pela legislação é incentivado e os processos biológicos utilizados envolvem o uso de enzimas e/ou microrganismos para degradação da OTA e são preferenciais pela especificidade, bem como pelas condições brandas para a detoxificação. O objetivo do trabalho foi estudar a ação de carboxipeptidase A nos níveis e na toxicidade de OTA, visando aplicar a técnica para detoxificar farinhas de trigo. Primeiramente foi estimado o risco de exposição à ocratoxina A pelo consumo de farinhas de trigo. Para isso foram estabelecidas condições de determinação de OTA em farinhas de trigo, empregando técnicas de estatística multivariada para definir os principais interferentes na extração de OTA pelo método de QuEChERS e detecção em CLAE-FL. O método validado permitiu a avaliação da ocorrência natural em 20 amostras de farinha de trigo, estando estas contaminadas na faixa de 0,22 a 0,85 µg.kg-1 , apresentando um valor de ingestão diária de 0,08 ngOTA.dia-1 .kgmassacorpórea -1 e uma disponibilidade de 94,4%. Em seguida foi realizada a padronização da extração de carboxipeptidase A em biomassa de Rhizopus oryzae que consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40 kHz e a triagem de agentes biológicos para degradação de OTA. Para o estudo da degradação in vitro de OTA, método de extração e detecção de OTA e OTα em CLAEFL foi validado e o processo de degradação foi realizado com Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, obtendo-se uma redução máxima de 63,5% e 57,7%, respectivamente. A degradação apresentou uma correlação alta (R>0,9) e significativa (p<0,05) com a produção de Otα, indicando que ocorreu a produção de enzimas capazes de hidrolisar a micotoxina, por exemplo, a carboxipeptidase A. O estudo da toxicidade de OTA e seu metabólito OTα foi realizado em neutrófilos humanos, onde foi observado a ausência de efeito tóxico de OTα. Também foi determinado o mecanismo de toxicidade de OTA pelo aumento de Ca2+ intracelular pela liberação a partir das reservas internas. Esta liberação, subsequentemente, provoca uma cascata de eventos, nomeadamente: a produção de espécies reativas, depleção de ATP, perda de ΔΨm, levando à morte por necrose. Para reduzir o risco de exposição à micotoxina pela ingestão de matéria prima contaminada, carboxipeptidase A extraída de diferentes fontes foi aplicada na hidrólise de OTA em farinha de trigo para posterior determinação do conteúdo residual de OTA e OTα, empregando método validado. O estudo mostrou uma redução de OTA entre 16,8 e 78,5% e produção de OTα entre 2 a 8,2 ng.g-1 . As carboxipeptidases mais promissoras para degradação foram as provenientes de Rhizopus e Trichoderma e a carboxipeptidase comercial. Ficou demonstrado que se pode recomendar a aplicação de enzimas proteolíticas, tipo carboxipeptidase, para reduzir o risco de exposição à micotoxina quando utilizada matéria prima contaminada, por exemplo, farinha de trigo para diferentes processos. A transformação de OTA para OTα e seus efeitos na redução da toxicidade da micotoxina corroboram com esta afirmação.
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Deoxynivalenol (DON) degradation and peroxidase enzyme activity in submerged fermentation
(2011) Buffon, Jaqueline Garda; Kupski, Larine; Furlong, Eliana Badiale
This work aims to evaluate deoxynivalenol degradation by Aspergillus oryzae and Rhizopus oryzae in a submerged fermentation system and to correlate it to the activity of oxydo-reductase enzymes. The submerged medium consisted of sterile distilled water contaminated with 50 μg of DON and 4 × 106 spore.mL–1 inoculum of Aspergillus oryzae and Rhizopus oryzae species, respectively in each experiment. Sampling was performed every 24 hours for monitoring the peroxidase specific activity, and every 48 hours for determining mycotoxin levels. Results showed that the fungi species were able to decrease DON levels as the peroxidase activity increased. The 48 hours fermentation interval presented the highest peroxidase specific activity (ΔABS/minute.μg.protein–1), 800 and 198, while the highest DON degradation velocity was 10.8 and 12.4 ppb/hour, respectively in both cases for Rhizopus oryzae and Aspergillus oryzae.
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Disponibilização de compostos fenólicos a partir de subprodutos agroindustriais
(2025) Oertel, Raquel Velasques; Buffon, Jaqueline Garda; Kupski, Larine
Os compostos fenólicos são metabólitos secundários amplamente presentes em resíduos de frutas, cereais e outros subprodutos agroindustriais. Essas substâncias possuem estruturas químicas que lhes conferem a capacidade de neutralizar radicais livres, protegendo as células contra danos oxidativos, além de apresentarem uma gama de atividades biológicas, incluindo propriedades antimicrobianas. Esses compostos podem estar na forma livre ou ligada a macromoléculas e podem ser obtidos de diferentes fontes naturais. Neste contexto, a fermentação em estado sólido tem se mostrado uma alternativa promissora para a disponibilização de compostos fenólicos ligados a macromoléculas em matrizes lignocelulósicas. O fungo filamentoso Trichoderma reesei destaca-se pelo seu sistema extracelular de enzimas lignocelulolíticas que possibilitam a liberação de compostos bioativos. Portanto, o objetivo deste estudo foi obter os compostos fenólicos a partir de subprodutos agroindustriais por meio da fermentação em estado sólido com o fungo T. reesei. Foram utilizados como substratos o bagaço de uva fermentado e farelo de arroz integral, doados por empresas do Rio Grande do Sul. Esses materiais foram secos, moídos, peneirados para atingir uma granulometria de 0,5 mm. Os compostos fenólicos foram obtidos por cultivo em estado sólido utilizando T. reesei em biorreatores do tipo bandeja. Os substratos foram adicionados junto de uma solução nutriente (2 g/L KH2PO4, 1 g/L MgSO4, 8 g/L NH2CONH2 em HCl 0,4 N). A inoculação foi realizada com diferentes concentrações de esporos e adicionada água estéril para correção da umidade. A concentração de farelo de arroz, a concentração de esporos e o teor de umidade foram avaliados utilizando delineamento composto central (DCC), tendo como variável resposta o conteúdo de compostos fenólicos livres. Um estudo cinético foi realizado, na melhor condição, durante 120 h a 30°C, com amostragem a cada 24 h. A concentração de compostos fenólicos foi determinada por reação colorimétrica utilizando o reagente Folin-Ciocalteu após extração com metanol na proporção 1:10 (m/v). O crescimento fúngico foi avaliado no estudo cinético pelo conteúdo de glicosamina, e o consumo de substrato pelo conteúdo de açúcares redutores determinado pelo método 3,5 dinitrossalicílico (DNS). O perfil dos compostos fenólicos foi identificado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a um detector de arranjo de diodos (DAD). Os efeitos significativos observados neste estudo foram a concentração de esporos e a umidade. Na condição de 50% de umidade, 40% de farelo de arroz e 4×105 esporos/g, o conteúdo de compostos fenólicos foi de 6030,37 μg/g, o que correspondente a um aumento de 176% após 24h de cultivo. Inicialmente, os níveis de açúcares redutores e totais eram elevados 24,23 mg/g e 63,75 mg/g e foram gradualmente consumidos ao longo do cultivo. A maior quantidade de glicosamina quantificada na biomassa do fungo T. reesei foi de 44,68 μg/g em 96 h. O fungo T. reesei foi capaz de produzir um complexo enzimático eficiente, destacando-se na liberação de ácidos fenólicos, com predominância do ácido siríngico (18,4 μg/g) após 24 h. Outros compostos identificados foram os ácidos como protocatecóico (2,9μg/g), cumárico (2,4 μg/g), ferúlico (1,7 μg/g), gálico (1,4 μg/g), vanilina (0,5 μg/g) e hidroxibenzóico (0,4 μg/g). A pesquisa propõe uma alternativa sustentável para o reaproveitamento de resíduos agroindustriais, contribuindo para a economia circular e alinhando-se aos princípios da química verde.
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Endoglucanase and total cellulase from newly isolated Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei: production, characterization, and thermal stability
(2014) Kupski, Larine; Pagnussatt, Fernanda Arnhold; Buffon, Jaqueline Garda; Furlong, Eliana Badiale
A multienzymatic complex production was evaluated, as well as endoglucanase and total cellulase characterization, during solid-state fermentation of rice industry wastes with Rhizopus oryzae CCT 7560 (newly isolated microorganism) and Trichoderma reesei QM 9414 (control). R. oryzae produced enzymes with higher activity at 15 h of fermentation (5.1 and 2.3 U g−1 to endoglucanase and total cellulase), while T. reesei produced them at 55 h (15.3 and 2.8 U g−1 to endoglucanase and total cellulase). The optimum temperature for total cellulase and endoglucanase was 60 °C. For Trichoderma and Rhizopus, the optimum pH was 5.0 and 6.0 for total cellulase and 6.0 and 5.0 for endoglucanase, respectively. The enzymes produced by Rhizopus presented higher stability at the temperature range evaluated (25–100 °C); the endoglucanase KM value was 20 times lower than the one found for Trichoderma. The characterization of the cellulolytic enzymes from the fungal species native of rice husk revealed that they can be more efficient than the genetically modified enzymes when rice husk and rice bran are used as substrates.
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Fusarium graminearum growth inhibition mechanism using phenolic compounds from Spirulina sp
(2013) Pagnussatt, Fernanda Arnhold; Kupski, Larine; Darley, Francine Toralles; Filoda, Paula Freitas; Del Ponte, Emerson Medeiros; Buffon, Jaqueline Garda; Furlong, Eliana Badiale
The application of natural antifungal substances is motivated by the need for alternatives to existing methods that are not always applicable, efficient, or that do not pose risk to consumers or the environment. Furthermore, studies on the behaviour of toxigenic species in the presence of natural fungicides have enabled their safe application in the food chain In this study, Spirulina LEB-18 phenolic extract was assessed for its antifungal activity on 12 toxigenic strains of Fusarium graminearum isolated from barley and wheat. The susceptible metabolic pathways were assessed through the determination of structural compounds (glucosamine and ergosterol) and enzyme activity of the microorganisms’ primary metabolism. The results indicate that phenolic extracts reduced the growth rate of the toxigenic species investigated. The IC50 was obtained by applying 3 to 8% (p/p) of phenolic compounds in relation to the culture medium. The use of this natural fungicide proved promising for the inhibition of fungal multiplication, especially in terms of the inactivation of enzymatic systems (amylase and protease) of Fusarium graminearum.
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Produção de celulases a partir de resíduo da indústria arrozeira empregando Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei
(2012) Kupski, Larine; Furlong, Eliana Badiale; Buffon, Jaqueline Garda
A produção de enzimas é um campo consolidado da biotecnologia, onde são utilizados processos de fermentação submersa, porém nas últimas décadas vem sendo observada a tendência de utilizar a fermentação em estado sólido para produção de diversas enzimas. As vantagens deste processo são simplicidade de meio de cultura, baixa demanda de energia, diminuindo o custo de produção. Dentre as enzimas utilizadas industrialmente, as celulases tem seu emprego destacado principalmente no Brasil pela aplicação na produção de biocombustíveis. O objetivo do trabalho foi produzir celulase através de fermentação em estado sólido com os micro-organismos GRAS Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, tendo casca e farelo de arroz como substrato. A caracterização físico-química dos substratos foi realizada. As condições de extração enzimática foram estudadas, variando-se o solvente extrator, o tempo e a velocidade de agitação. Para estabelecer condições ótimas de produção enzimática foi estuda a influencia do teor de casca no meio e a umidade inicial no processo fermentativo através de planejamento experimental; o tempo de fermentação, tipo de biorreator e solução nutriente utilizados. As enzimas foram caracterizadas quanto ao pH ótimo, temperatura ótima, estabilidade a temperatura; os parâmetros KM e Vmáx também foram avaliados. Além da produção celulolítica foi avaliada a produção de enzimas amiloliticas e pectinolíticas. A caracterização físico-química dos substratos indicou que a casca de arroz seria um bom indutor da atividade celulolítica, devido ao seu teor de fibras (43,6%). O melhor solvente para extrair o complexo enzimático foi NaCl 0,5% durante 30 min a 25°C sem agitação. Para Rhizopus oryzae as condições ideais para produção celulolítica foram obtidas com 15 h de fermentação em biorreatores de bandeja contendo como substrato 82,5% de casca e 17,5% de farelo de arroz e teor inicial de umidade de 30%, obtendo-se 0,094 e 0,206 U.mgproteína-1, para celulase total e endoglicanase, respectivamente. Para Trichoderma reesei a condição ideal consistia em fermentar em erlenmeyers, contendo somente casca de arroz com umidade inicial de 50%, durante 55 h, obtendo-se 0,110 e 0,605 U.mgproteína-1, para celulase total e endoglicanase, respectivamente. Para ambos os micro-organismos foi utilizada a solução nutriente contendo KH2PO4, (NH4)2SO4, CO(NH2)2, MgSO4.7H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4.H2O, CoCl2, ZnSO4.7H2O. O pH ótimo para atuação da endoglicanase foi de 5,0 e 6,0 e da celulase total 6,0 e 5,0 para Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, respectivamente. A temperatura ótima das enzimas celulolíticas foi 60 ºC sendo as produzidas por Rhizopus oryzae mais estáveis termicamente que as de Trichoderma reesei. As endoglicanase produzidas por Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei apresentaram valores de KM de 0,01 e 0,20 mg/mL, respectivamente.
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Promising Antifungal Effect of Rice (Oryza sativa L.), Oat (Avena sativa L.) and Wheat (Triticum aestivum L.) Extracts
(2013) Pagnussatt, Fernanda Arnhold; Bretanha, Cristiana Costa; Kupski, Larine; Buffon, Jaqueline Garda; Furlong, Eliana Badiale
The antifungal activity from rice, oat and wheat crude proteic extracts on the development of Fusarium graminearum CQ244, Aspergillus flavus CCT 1217 and Rhizopus oryzae CCT 7560 was investigated intending to identify their potential as natural fungicides. The crude proteic extracts from cereals were prepared in ethanol and the antifungal properties were evaluated using the glucosamine, produced by the biomass as a response. F. graminearum was inhibited by wheat extracts, while that A. flavus was inhibited by oat extracts. R. oryzae was few inhibited. Proteic extracts in higher concentrations may be applied in field and/or storage, as natural antifungal.
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Solid-State Fermentation for the Enrichment and Extraction of Proteins and Antioxidant Compounds in Rice Bran by Rhizopus oryzae
(2012) Kupski, Larine; Cipolatti, Eliane Pereira; Rocha, Meritaine da; Oliveira, Melissa dos Santos; Soares, Leonor Almeida de Souza; Furlong, Eliana Badiale
The objective of this work was to evaluate the solid-state fermentation with Rhizopus oryzae CCT 7560 of rice bran for the enrichment of proteins and the antioxidant compounds in the fermented biomass. Fermentation was performed in tray bioreactors at 30ºC for 120 h. Protein extraction was done at alkaline pH, followed by precipitation with acetone. Phenolic compounds were extracted with cold methanol. The maximum protein was recovered from after 120 h (26.6%). The content of total phenolic compounds increased during the fermentation and was maximum after 96 h, which inhibited the DPPH radical by 87%. The promising characteristics of the protein and phenolic extracts of the biomass suggested the application in the coating composition for vegetal tissues preservation.