EQA – Mestrado em Engenharia e Ciência de Alimentos (Dissertações)
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- ItemAdsorção e purificação da enzima beta-galactosidade de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 através de cromatografia de troca iônica(2008) Medeiros, Fabiana Oliveira de; Kalil, Susana JulianoA beta-galactosidase é uma enzima utilizada industrialmente na hidrólise da lactose do leite gerando derivados lácteos destinados a pessoas intolerantes a este açúcar. Sua importância é salientada por sua atividade de galactosiltransferase, responsável pela síntese de galactooligosacarídeos, compostos com propriedades prebióticas. Quando produzida por leveduras do gênero Kluyveromyces, esta enzima é intracelular. Tendo em vista que as etapas de purificação, principalmente quando aplicadas a produtos intracelulares, são responsáveis por grande parte dos custos de produção, é importante estudar técnicas que possam ser aplicadas diretamente ao extrato bruto. A presente dissertação teve como principal objetivo estudar a adsorção e purificação da enzima beta-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 através de cromatografia de troca iônica. A enzima foi produzida por fermentação submersa em frascos agitados a 30 °C, 180 rpm por 96 horas. Primeiramente foi avaliado o uso de diferentes relações biomassa:solvente na extração da enzima utilizando ondas ultrassônicas. Foram testadas relações de 2,62 a 50 mg.mL-1, avaliando a resposta em termos de atividade enzimática e rendimento de extração. Em seguida foi determinada a estabilidade da enzima quanto à temperatura e pH. No estudo da estabilidade à temperatura, a enzima foi incubada a -18°C, 4°C, 10°C e 25°C. A estabilidade ao pH foi avaliada para valores entre 4,6 e 8,6, nas temperaturas de 37°C, 25°C, 10°C e 4°C. A atividade residual foi acompanhada ao longo do tempo. A adsorção da enzima pela resina aniônica Q Sepharose Fast FlowTM foi estudada a 4°C e 10°C e em pH de 6,5 a 7,5, através de ensaios cinéticos em reatores agitados contendo a enzima e a resina, a 200 rpm por 360 minutos, onde foram determinados os coeficientes de partição da enzima no equilíbrio para cada condição. A capacidade de adsorção da resina, nas velocidades de alimentação da enzima de 20 cm.h-1 e 40 cm.h-1, foi determinada através da construção de curvas de ruptura em coluna de leito fixo do tipo C10/20. Na purificação da enzima foi avaliado o efeito das variáveis pH de eluição e volume necessário para o gradiente linear salino. Para isso, foi utilizado um planejamento experimental onde o pH variou de 5,5 a 7,5 enquanto que o volume para o gradiente salino variou de 10 a 30 vezes o volume de leito. Na etapa de concentração da enzima beta-galactosidase, a melhor condição foi o uso de uma suspensão celular contendo 40 mg.mL-1, a qual proporcionou uma atividade de 42 U.mL-1. A enzima foi mais estável nas temperaturas de 10°C e 4°C, para a faixa de pH de 6,6 a 8,6. A maior adsorção da enzima pela resina de troca iônica ocorreu em pH 7,5 e temperatura de 10°C, obtendo-se um coeficiente de partição de 61,2, assim como utilizando velocidade superficial de alimentação de 20 cm.h-1 expressa pelo valor de q igual a 104,4 U.mL-1. Foi possível obter e validar um modelo empírico linear para descrever o processo de purificação da enzima por cromatografia de troca iônica em termos de rendimento e fator de purificação. A melhor condição para purificação da beta galactosidase foi pH de eluição de 5,5 e volume para o gradiente linear salino igual a vinte vezes o volume de leito, obtendo-se rendimento de 85,5% e fator de purificação de 12 vezes.