EQA - Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos
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- ItemPurificação de xilanases de Aureobasidium pullulans CCT 1261 e sua aplicação na produção de xilo-oligossacarídeos(2021) Corrêa Junior, Luiz Cláudio Simões; Kalil, Susana Juliano; Burkert, Janaina Fernandes de MedeirosEnzimas xilanolíticas estão envolvidas na hidrólise da xilana, sendo que as principais incluem as endo-β-1,4-xilanases (xilanases) e β-xilosidases. Estas podem ser aplicadas na bioconversão de materiais lignocelulósicos em produtos de valor agregado, como xilo-oligossacarídeos (XOs). Os XOs são oligossacarídeos que apresentam atividade prebiótica, sendo obtidos preferencialmente por hidrólise enzimática. A produção de xilanases por leveduras merece destaque, pois são secretadas enzimas com alta atividade de endo-β-xilanases e baixa de βxilosidases, característica desejável para a produção de XOs. Técnicas de purificação podem ser aplicadas para separação destas enzimas, de forma a favorecer a produção de XOs pela atenuação da produção de xilose. Este trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo para purificação de xilanases de Aureobasidium pullulans, bem como caracterizar e aplicar o extrato enzimático purificado na produção de XOs. Os cultivos para produção da enzima foram realizados em frascos Erlenmeyer aletados com 147 mL de meio estéril (pH 7.0) contendo (g/L) farelo de arroz (61,9), extrato de levedura (1,5) e (NH4)2SO4 (3,6), além de 3 mL de inóculo. Os frascos foram mantidos sob agitação orbital (150 rpm) e a 28 °C por 72 h. As técnicas de purificação da enzima estudadas foram a precipitação com sulfato de amônio (NH4)2SO4 e etanol em diferentes concentrações, em um único estágio e de forma fracionada (dois ou mais estágios). A enzima purificada foi caracterizada em termos do pH e temperatura ótimo, efeito de íons metálicos na atividade, parâmetros cinéticos, estabilidade térmica e em relação ao pH. A produção de XOs foi realizada a 45 °C, 3 % (m/v) de xilana de faia, pH 4,5, relação enzima:substrato 200 U/g, 180 rpm, por 24 h. Nestas condições de hidrólise foi avaliado o efeito de íons Ca2+ . A purificação da xilanase por precipitação fracionada (0-20/20-60 %) com (NH4)2SO4 foi mais eficiente, com fator de purificação (FP) 10,27 vezes e recuperação da atividade enzimática de 48,6 % que a precipitação fracionada com etanol (FP = 5,54 e recuperação da atividade enzimática de 43,01 %). A xilanase purificada exibiu temperatura e pH ótimos de 50 °C e 4,5, respectivamente. A constante de Michaelis-Menten para a enzima purificada foi de 74,9 mg/mL. A adição dos sais CaCl2, ZnCl2 e FeCl3 no meio reacional promoveu o aumento da atividade, sendo que o Ca2+ (10 mmol/L) destacou-se entre os demais pois aumentou a atividade da xilanase em 44 %. A xilanase purificada com sal apresentou maior estabilidade térmica a 45 °C e pH 4,5 com meia-vida (t1/2) de 169 h. Nestas condições e na presença de íons Ca2+ (10 mmol/L) a enzima foi ainda mais estável (t1/2= 231 h). Nas reações de hidrólise os teores de XOs totais (6,7 mg/mL) e a conversão da xilana em XOs (22,3 %) não apresentaram diferenças significativas (p>0,05) entre 2 e 24 h de processo. Os hidrolisados apresentaram composição majoritária de xilobiose, xilotriose e xilose. A adição de íons Ca2+ não contribuiu para o aumento do conteúdo de XOs totais nem para maior conversão de xilana em XOs, porém o hidrolisado apresentou menor conteúdo de xilose e maior de xilobiose em 24 h.
- ItemCampos magnéticos aplicados em cultivos com Phaffia rhodozyma: avaliação do crescimento, produção de carotenoides e extração com ruptura química(2020) Silva, Pedro Garcia Pereira da; Santos, Lucielen Oliveira dos; Burkert, Janaina Fernandes de MedeirosOs carotenoides constituem um grupo de pigmentos naturais de coloração amarela, laranja e vermelha que possuem importante atividade biológica devido as suas propriedades antioxidantes. Com a crescente demanda por tais compostos para serem utilizados em produtos alimentícios, farmacêuticos, cosméticos e rações, o interesse nos carotenoides naturalmente obtidos por processos biotecnológicos vem aumentando. A levedura Phaffia rhodozyma se destaca como produtora de carotenoides, onde seu conteúdo pode ser aumentado através da estimulação da síntese com a aplicação de campos magnéticos (CM). Desta forma o objetivo deste estudo foi avaliar a influência dos campos magnéticos no cultivo de P. rhodozyma NRRL Y-17268 e o processo de extração de carotenoides por ruptura química. Primeiramente a aplicação do CM durante o cultivo do inóculo foi avaliada, sendo testadas as condições de 0 mT (controle) e 30 mT. Obteve-se aumento de 12,8% na concentração celular em 24 h no cultivo com a aplicação de CM em relação ao ensaio controle, sendo padronizada como melhor alternativa para o cultivo do inóculo. Desta forma nos ensaios posteriores o cultivo do inóculo foi feito em frascos agitados, caldo YM (yeast extract – malt extract), 25 °C, 150 rpm, 24 h, sob ação de 30 mT. Já os cultivos para a produção de carotenoides foram feitos em frascos agitados orbitalmente (500 mL) com 225 mL do meio YM, pH inicial 6,0, 10% de inóculo (108 cél mL-1), 25 ºC, 180 rpm por 168 h. Nesta etapa foram testados diferentes tempos de exposição ao CM (30 mT) ao longo de 168 h de cultivo e ensaio controle (sem a aplicação do CM). Em todos os cultivos foram determinados o pH e as concentrações de biomassa, açúcares redutores e carotenoides. Para a extração dos carotenoides da biomassa foi realizada a ruptura química das células utilizando dimetilsulfóxido (DMSO) e posteriormente a extração dos carotenoides com acetona e hexano obtendo-se os extratos carotenogênicos. Sendo que os melhores resultados de concentração de biomassa (7,23 ± 0,33 g L-1), carotenoides volumétricos (1189,81 ± 26,18 µg L-1) e produtividade em carotenoides (12,39 ± 1,11 µg L-1 h-1) foram alcançados em 96 h quando o CM foi aplicado durante todo o cultivo. Nesta condição a concentração volumétrica de carotenoides foi 42,9% maior que o ensaio controle. Após determinadas as melhores condições de cultivo foram avaliadas diferentes formas de extração por ruptura química e pré-tratamentos na biomassa para melhorar o processo de extração dos carotenoides. Nos ensaios de ruptura celular seguida de extração (3 repetições) utilizando biomassa que foi seca (24 h) e congelada (24 h) foi possível observar concentração volumétrica de carotenoides de 1620,39±59,34 µg L-1. Esses resultados nos permitem concluir que após serem definidas as melhores condições de cultivo com CM, pré-tratamento da biomassa e extração de carotenoides, foi possível reduzir o tempo total de processo em escala laboratorial em 120 h em relação a metodologia atualmente utilizada pelo grupo de pesquisa.
- ItemMaximização da produção de endo-β-1,4-xilanase por Aureobasidium pullulans CCT 1261 e aplicação do extrato enzimático na síntese de xilo-oligossacarídeos e clarificação de suco(2020) Souza, Nathiéli Bastos de; Kalil, Susana JulianoEndo-β-1,4-xilanases são enzimas capazes de hidrolisar a cadeia da xilana e produzir xilooligossacarídeos (XOs), que apresentam uma ampla gama de aplicações industriais. A maximização da produção de endo-β-1,4-xilanases por micro-organismos pode reduzir custos e fornecer uma enzima com alta capacidade catalítica, para aplicação no processo de clarificação de sucos e produção de XOs. Esse estudo teve como objetivo, maximizar a produção de endo-β-1,4-xilanases por Aureobasidium pullulans CCT 1261 utilizando casca de aveia pré-tratada como fonte de xilana, bem como a caracterização e aplicação da enzima na síntese de XOs e clarificação de suco de laranja. Primeiramente, os pré-tratamentos alcalinos e de ultrassom foram aplicados na casca de aveia, após, foi utilizada como substrato na produção de enzimas, realizada em frascos Erlenmeyer com 150 mL de meio de cultura e 2% de inóculo da levedura, incubados a 28 ºC por 120 h. A maximização da produção da endo-β-1,4-xilanase, foi realizada por Delineamento Composto Central (DCC) 24 , e os efeitos do pH (3,0-7,0), concentrações de casca de aveia pré-tratada (10-50 g/L), extrato de levedura (0,5-1,5 g/L) e KH2PO4 (0-5 g/L) foram avaliados. A atividade da endo-β-1,4-xilanase, proteínas solúveis e pH, foram medidas durante o tempo de cultivo. O efeito das ondas ultrassônicas sobre a atividade enzimática quando aplicada no extrato enzimático bruto e na xilana de madeira de faia foram avaliados, utilizando uma frequência de 20 kHz e intensidade de 0,5 a 7 W/mL, durante o período de 1, 3 e 5 min. A precipitação fracionada de sal com sulfato de amônia (0- 30%/30-60%) foi aplicado para purificação do extrato enzimático. Também foram determinados temperatura e pH ótimos, parâmetros cinéticos (Km e Vmax) e estabilidade térmica para o extrato enzimático bruto. Posteriormente a endo-β-1,4-xilanase foi aplicada na hidrólise enzimática de xilana de madeira de faia e na clarificação de suco de laranja. A produção máxima da xilanase foi obtida utilizando 50 g/L de casca de aveia pré-tratada, pH 3,0, 1,5 g/L de extrato de levedura e 5,0 g/L de KH2PO4. Após os ensaios de maximização, a atividade da endo-β-1,4- xilanase foi 6,37 vezes maior que no ensaio controle. A aplicação de ondas ultrassônicas no extrato enzimático bruto (1 W/mL por 3 min) e na xilana de madeira de faia (5 W/mL por 5 min) melhorou a atividade da endo-β-1,4-xilanase em 4,3% e 16,6%, respectivamente. A purificação enzimática pela precipitação de sal não foi possível. Quanto à caracterização do extrato bruto, observou-se uma faixa de temperatura e pH ótimos de 45 a 50 ºC e 5,0, respectivamente. A meia vida a 40 ºC foi determinada em 11 dias e valor z 4,63 ºC. O extrato enzimático bruto apresentou Vmax de 2000 U/mL e Km de 69,8 mg/mL. Durante a clarificação do suco de laranja com aplicação de endo-β-1,4-xilanase bruta, observou-se um aumento 28,3% na claridade e 5,9% do teor de açúcares redutores e redução de 23,9% na turbidez. Por aplicação do extrato enzimático bruto na hidrólise da xilana, foi observada uma concentração final de 12,9 mg/mL de XOs totais com 24 h de processo. Além disso, o uso de xilana de madeira de faia pré-tratada por ultrassom, aumentou a concentração de oligômeros em 20%. Concluindo com o estudo, que foi possível a maximização da produção de endo-β-1,4-xilanase, a caracterização do extrato enzimático bruto e a aplicação eficiente da enzima em processos de produção de XOs e clarificação de suco de laranja.