Abstract:
Tricotecenos são compostos de interesse mundial por serem contaminantes de grãos e alimentos. Estudos vêm enfatizando a ação de enzimas na degradação dessas micotoxinas, detoxificando as matrizes sem alterar as propriedades funcionais e nutricionais dos alimentos. O objetivo desse estudo foi avaliar o mecanismo de degradação de tricotecenos A e B por ação de enzimas hidrolíticas e oxidativas. As enzimas avaliadas foram: lacase, peroxidase, lipase e esterase. Os tricotecenos avaliados foram: Toxina T-2, Deoxinivalenol (DON), Nivalenol, 3-Acetildeoxinivalenol (3-ADON) e 15-Acetildeoxinivalenol (15-ADON). Um método cromatográfico foi adaptado e validado para determinação dos tricotecenos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a detector ultravioleta (UV). A extração dos tricotecenos da solução modelo dos ensaios de biodegradação ocorreu por extração líquido-líquido assistida por salting-out. A determinação da concentração residual de tricotecenos visando estimar a degradação, foi realizada em soluções modelo submetidas a ação de enzimas em diferentes tempos de incubação, concentração enzimática e cinéticas bioquímica e de degradação. Foi também investigada a formação de produtos de degradação, pelas técnicas de HPLC acoplado a espectrometria de massas em série (MS/MS) e HPLC de alta resolução (Orbitrap). As soluções modelo para as enzimas hidrolíticas e oxidativas padronizada, foram: tampão fosfato 0,05 mol L-1 pH 7 e pH 5, respectivamente. Lacase degradou 3-ADON (87%) e toxina T-2 (96%) utilizando 0,15 U mL-1 de enzima e 2 μg mL-1 dos tricotecenos. A interação de lacase com DON mostrou possível ação de adsorção enzimática com degradação de 72,4% com 2 h de incubação. Ficou demonstrada a necessidade do emprego da técnica de LC-MS/MS para confirmação da degradação em sistema lacase/ABTS. Ação de adsorção enzimática também pode explicar DON (4,1 μg mL-1) em interação com peroxidase (0,00001 U mL-1) mostrando degradação de 92,5% em 8 h de incubação. 15-ADON (2,7 μg mL-1) apresentou degradação de 97% em interação com peroxidase (0,62 U mL-1) com 8 h de incubação. A degradação de 3-ADON (3,8 μg mL-1) e toxina T-2 (7,7 μg mL-1) em interação com peroxidase (0,62 U mL-1), não se ajustou a nenhum modelo cinético, apresentando diferenças nos percentuais de degradação em relação aos encontrados em ensaios anteriores. Esses resultados também enfatizam a necessidade do emprego de LC-MS/MS na confirmação da degradação. As enzimas hidrolíticas possuem ação degradativa sobre os tricotecenos, porém não apresentaram ajuste aos modelos cinéticos. HPLC-Orbitrap confirmou a ação degradativa da enzima lacase sobre 3-ADON e toxina T-2, pela formação de dímeros. A degradação enzimática dos tricotecenos poderá possibilitar a aplicação das enzimas em processos industriais, visando à descontaminação de alimentos contaminados.
Trichothecenes are compounds of worldwide interest because are contaminants of grains and foods. Studies have emphasized enzymatic action in these mycotoxins degradation, detoxifying the matrices without altering the functional and nutritional properties of the foods. The objective of this study was evaluated the mechanism of trichothecenes A and B degradation by enzymes hydrolytic and oxidative action. Enzymes evaluated were: laccase, peroxidase, lipase and esterase. Trichothecenes evaluated were Toxin T-2, Deoxynivalenol (DON), Nivalenol, 3-Acetyldeoxynivalenol (3-ADON) and 15-Acetyldeoxynivalenol (15-ADON). A chromatographic method was suitable and validated for trichothecenes determination by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to ultraviolet (UV) detector. Trichothecenes extraction from model solution of biodegradation assays occurred by salting-out assisted liquid-liquid extraction. Determination of trichothecenes residual concentration to estimate the degradation was carried out in model solutions submitted to enzymes action in different incubation times, enzymatic concentration and biochemical and degradation kinetics. Degradation products formation was also investigated by HPLC coupled with mass spectrometry (MS/MS) and high resolution HPLC (Orbitrap). Model solutions for the hydrolytic and oxidative enzymes were: phosphate buffer 0.05 mol L-1 pH 7 and pH 5, respectively. Lacase degraded 3-ADON (87%) and T-2 toxin (96%) using 0.15 U mL-1 of enzyme and 2 μg mL-1 of trichothecenes. Laccase interaction with DON showed a possible enzymatic action of adsorption, with 72.4% of degradation during incubation for 2 h. It demonstrated the necessity of LC-MS/MS technique employing to confirming the degradation in laccase/ABTS system. Enzymatic adsorption action can also explain DON (4.1 μg mL-1) in interaction with peroxidase (0.00001 U mL-1) showing 92.5% of degradation during 8 h of incubation. 3-ADON (3.8 μg mL-1) and T-2 toxin (7.7 μg mL-1) degradation, in interaction with peroxidase (0.62 U mL-1) did not adjustment any kinetic model, presenting differences in the percentages of degradation in relation to those found in previous tests. These results also emphasize the necessity LC-MS/MS use in confirmation of degradation. Hydrolytic enzymes have degradative action on the trichothecenes, but did not present an adjustment to the kinetic models. HPLC-Orbitrap confirmed the degradative action of laccase enzyme on 3-ADON and T-2 toxin, by the formation of dimers. Enzymatic degradation of trichothecenes may allow the enzymes application in industrial processes, aiming at the decontamination of contaminated food and food raw materials.
