Mecanismo de rna de interferência (RNAi) como uma ferramenta biotecnológica para a sanidade e reprodução do Camarão Branco Litopenaeus vannamei

Abstract

Os estudos descritos nesta Tese envolvem a aplicação de métodos para o desenvolvimento da tecnologia do RNAi direcionada a terapia gênica de camarões L. vannamei infectados com o vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV) e ao estudo da reprodução do L. vannamei através do silenciamento pós-transcricional do gene que codifica para hormônio inibidor dos gônadas (GIH). No Capítulo I, metodologias para a detecção e quantificação por RT-qPCR e qPCR dos vírus da Mionecrose Infecciosa (IMNV) e do vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV), respectivamente, foram desenvolvidas e efetivas para a detecção inédita da ocorrência da co-infecção com ambos os vírus em espécimes do camarão L. vannamei. No Capítulo II foi demostrado que o padrão de transcrição dos principais genes chaves do mecanismo de RNAi (Sid-1, Dicer-2 e Argonauta-2) do L. vannamei não é afetado pela infecção causada pelo IMNV quando da injeção de diferentes concentrações do inóculo viral e que o número médio de 2,55 x 103 cópias do IMNV detectados em tecido hemocítico pode ser considerado seguro para os sistemas de cultivos de L. vannamei sob condições ótimas. O Capítulo III descreve a produção de moléculas de dsRNA relacionadas a diferentes ORFs do genoma do IMNV (dsRNA-IMNV ORF1a, dsRNA-IMNV ORF1b ou dsRNA-IMNV ORF2) para a terapia de camarões L. vannamei infectados experimentalmente com 1,02 x 106 cópias do IMNV. Os tratamentos com as dsRNA-IMNV (ORF1a) e dsRNA- IMNV (ORF1b) se mostraram efetivos na inibição da replicação do IMNV resultando em sobrevivências de 90% e 80%, respectivamente, após 34 dias de desafio experimental. Os resultados obtidos neste capítulo sugerem uma exportação do sinal do RNAi pelo canal de transmembrana SID-1, sendo este evento diretamente associado à inibição da replicação do IMNV e, consequentemente, com a sobrevivência dos camarões desafiados. No Capítulo IV foi demostrado que apesar do “knockdown” dos níveis do mRNA do GIH detectados no pedúnculo ocular das fêmeas de L. vannamei injetadas com as dsRNA-GIH, o efeito sobre a expressão do mRNA da vitelogenina nos ovários e no diâmetro dos oócitos somente foi verificado no 37° dia pós injeção. Os resultado apresentados na presente tese confirmam o potencial da utilização da tecnologia do RNAi tanto para a terapia gênica de enfermidade virais como para o estudo da reprodução em camarões L.vannamei.

The studies described in this Thesis involve the application of methods for the development of RNAi technology for gene therapy of the shrimp L. vannamei infected with the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) and to study the reproduction of L. vannamei through the post-transcriptional silencing of the gene that encodes for the Gonadal Inhibitor Hormone (GIH). In Chapter I, methodologies for the detection and quantification by RT-qPCR and qPCR of the Infectious Myonecrosis Virus (IMNV) and the White Spot Syndrome Virus (WSSV), respectively, were developed and effective for the first detection of the occurrence of co-infection with both viruses in specimens of the shrimp L. vannamei. In Chapter II it was shown that the pattern of transcription of the main key-genes of RNAi (Sid-1, Dicer-2 and Argonauta-2) of L. vannamei is not affected by infection caused by IMNV when injecting different concentrations of viral inoculum and that the average number of 2.55 x 103 copies of IMNV detected in haemocytic tissue can be considered safe for farming systems of L. vannamei under optimal conditions. Chapter III describes the production of dsRNA molecules related to different ORFs of IMNV genome (dsRNA-IMNV ORF1a, dsRNA-IMNV ORF1b or dsRNA-IMNV ORF2) for therapy of L. vannamei experimentally infected with 1.02 x 106 copies of IMNV. The treatments with the dsRNA-IMNV (ORF1a) and dsRNA- IMNV (ORF1b) were effective in inhibiting the IMNV replication resulting in survival of 90% and 80%, respectively, after 34 days of experimental challenge. The results of this chapter suggest an export signal of RNAi by the SID-1 transmembrane channel, being this event directly related to the inhibition of the replication of the IMNV and, consequently, the survival of the challenged shrimps. In Chapter IV it was demonstrated that although the "knockdown" of the mRNA of the GIH levels detected in eyestalk of L. vannamei females injected with the dsRNA-GIH, the effect on mRNA expression of the vitellogenin in ovaries and in oocytes diameter, was only verified in the 37th day post-injection. The results presented in this thesis confirm the potential of the use of RNAi technology for both gene therapy of viral infirmities as well as for the study of reproduction in shrimps L.vannamei.