Abstract:
Desde 1992, o Vírus da Síndrome da Mancha Branca (WSSV) vem causando problemas para o desenvolvimento da carcinicultura em todo o mundo. Dentre as alternativas para o combate a esse vírus está a utilização de duplas fitas de RNA (dsRNAs) para bloquear a expressão dos genes virais através do mecanismo de RNA interferente (RNAi) presente em eucariontes. A produção e entrega dessas moléculas aos animais pode ser realizada in vitro (através de kits comerciais) ou in vivo (como por exemplo, através de bactérias gram-negativas como Escherichia coli). O uso de kits encarece o tratamento e E. coli tem potencial patogênico. Assim, a utilização bactérias probióticas como bioreatores de dsRNAs pode ser uma alternativa interessante. Dessa forma, esta dissertação teve como objetivo validar o potencial da cepa probiótica Bacillus subtilis manipulada para produção das dsRNAs, na proteção do camarão Litopenaeus vannamei contra o WSSV. Para isso, foi otimizada a produção dessas moléculas com o acréscimo de nutrientes aos meios de cultura. As dsRNAs foram extraídas e purificadas do probiótico e validadas quanto à sua capacidade de ativar o sistema RNAi nos hemócitos. Adicionalmente o probiótico vivo foi administrado na dieta dos animais e avaliado quanto à sua capacidade de ativar o sistema RNAi e, também, quanto à sua capacidade de proteger o camarão contra o WSSV. Os resultados mostraram que o enriquecimento dos meios de cultura aumentou significativamente (p<0,05) a produção das dsRNAs pelo probiótico. Tanto as dsRNAs purificadas injetadas nos camarões quanto o próprio probiótico administrado na dieta foram capazes de ativar o sistema RNAi, como evidenciado pelo aumento da expressão dos genes relacionados sid1 e argonauta2. Também, foi observado que o pré-tratamento por 15 dias com o probiótico é suficiente para ativar o sistema RNAi. Quando expostos ao vírus, os camarões tratados com o probiótico geneticamente modificado tiveram uma redução significativa (p<0,05) na carga viral, o que resultou em uma sobrevivência de 34%. Não foram observadas inclusões virais nas brânquias, cutícula e epitélio gástrico dos sobreviventes. Este estudo demonstra, pela primeira vez, que uma cepa probiótica geneticamente modificada para ativar o sistema RNAi contra um gene específico do WSSV é capaz de reduzir a carga viral e aumentar a sobrevivência do camarão.
Since 1992, the White Spot Syndrome Virus (WSSV) has been causing problems for the development of shrimp farming worldwide. Among the alternatives to control this virus is the use of double-stranded RNAs (dsRNAs) to block the expression of viral genes through the mechanism of RNA interference (RNAi) present in eukaryotes. The production and delivery of these molecules can be achieved in vitro through commercial kits or in vivo through gram-negative bacteria like Escherichia coli. The use of kits makes treatment more expensive and E. coli has a pathogenic potential. Thus, the use of probiotic bacteria as bioreactors of dsRNAs can be an interesting alternative. This dissertation aimed to validate the potential of a probiotic strain of Bacillus subtilis manipulated for the production of dsRNAs, in the protection of the shrimp Litopenaeus vannamei against WSSV. For this, the production of these molecules was optimized with the addition of nutrients to the culture media. The dsRNAs were extracted and purified from the probiotic and validated for their ability to activate the RNAi system in the hemocytes. In addition, the live probiotic was administered to the animals' diet and assessed for its ability to activate the RNAi system and also for its ability to protect shrimp against WSSV. The results showed that enrichment of the culture media significantly (p<0,05) increased the production of dsRNAs by the probiotic. Both the purified dsRNAs injected into the shrimp and the probiotic administered in the diet were able to activate the RNAi system, as evidenced by the increased expression of the related genes sid1 and argonaute2. Also, it was observed that the pretreatment for 15 days with the probiotic is sufficient to activate the RNAi system. When exposed to the virus, shrimp treated with the genetically modified probiotic had a significant (p<0,05) reduction in viral load, which resulted in a 34% survival. No viral inclusions were observed in the gills, cuticle and gastric epithelium of the survivors. This study demonstrates, for the first time, that a probiotic strain genetically modified to activate the RNAi system against a specific WSSV gene is capable of reducing viral load and increasing shrimp survival.
