Abstract:
A ocratoxina A (OTA), micotoxina encontrada em diferentes níveis e em diversas
matrizes, apresenta efeitos carcinogênicos, nefrotóxicos e teratogênicos. O
desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação a níveis permitidos
pela legislação é incentivado e os processos biológicos utilizados envolvem o uso de
enzimas e/ou microrganismos para degradação da OTA e são preferenciais pela
especificidade, bem como pelas condições brandas para a detoxificação. O objetivo do
trabalho foi estudar a ação de carboxipeptidase A nos níveis e na toxicidade de OTA,
visando aplicar a técnica para detoxificar farinhas de trigo. Primeiramente foi estimado o
risco de exposição à ocratoxina A pelo consumo de farinhas de trigo. Para isso foram
estabelecidas condições de determinação de OTA em farinhas de trigo, empregando
técnicas de estatística multivariada para definir os principais interferentes na extração de
OTA pelo método de QuEChERS e detecção em CLAE-FL. O método validado permitiu
a avaliação da ocorrência natural em 20 amostras de farinha de trigo, estando estas
contaminadas na faixa de 0,22 a 0,85 µg.kg-1
, apresentando um valor de ingestão diária de
0,08 ngOTA.dia-1
.kgmassacorpórea
-1
e uma disponibilidade de 94,4%. Em seguida foi realizada
a padronização da extração de carboxipeptidase A em biomassa de Rhizopus oryzae que
consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40
kHz e a triagem de agentes biológicos para degradação de OTA. Para o estudo da
degradação in vitro de OTA, método de extração e detecção de OTA e OTα em CLAEFL
foi validado e o processo de degradação foi realizado com Rhizopus oryzae e
Trichoderma reesei, obtendo-se uma redução máxima de 63,5% e 57,7%,
respectivamente. A degradação apresentou uma correlação alta (R>0,9) e significativa
(p<0,05) com a produção de Otα, indicando que ocorreu a produção de enzimas capazes
de hidrolisar a micotoxina, por exemplo, a carboxipeptidase A. O estudo da toxicidade de
OTA e seu metabólito OTα foi realizado em neutrófilos humanos, onde foi observado a
ausência de efeito tóxico de OTα. Também foi determinado o mecanismo de toxicidade
de OTA pelo aumento de Ca2+ intracelular pela liberação a partir das reservas internas.
Esta liberação, subsequentemente, provoca uma cascata de eventos, nomeadamente: a
produção de espécies reativas, depleção de ATP, perda de ΔΨm, levando à morte por
necrose. Para reduzir o risco de exposição à micotoxina pela ingestão de matéria prima
contaminada, carboxipeptidase A extraída de diferentes fontes foi aplicada na hidrólise de
OTA em farinha de trigo para posterior determinação do conteúdo residual de OTA e
OTα, empregando método validado. O estudo mostrou uma redução de OTA entre 16,8 e
78,5% e produção de OTα entre 2 a 8,2 ng.g-1
. As carboxipeptidases mais promissoras
para degradação foram as provenientes de Rhizopus e Trichoderma e a carboxipeptidase
comercial. Ficou demonstrado que se pode recomendar a aplicação de enzimas
proteolíticas, tipo carboxipeptidase, para reduzir o risco de exposição à micotoxina
quando utilizada matéria prima contaminada, por exemplo, farinha de trigo para
diferentes processos. A transformação de OTA para OTα e seus efeitos na redução da
toxicidade da micotoxina corroboram com esta afirmação.
Ochratoxin A (OTA), a mycotoxin found in different levels in various matrices, has
carcinogenic, nephrotoxic and teratogenic effects. The development of methods to reduce
this contamination levels to the one allowed by the legislation is encouraged and
biological methods which involve the use of enzymes and/or micro-organisms for OTA
degradation are preferred due its specificity as well as the mild conditions for
detoxification. The objective was to study the action of carboxypeptidase on OTA levels
and toxicity in order to apply the technique to detoxify wheat flours. First we estimated
the risk of exposure to ochratoxin A by the consumption of wheat flours. For that
conditions to determinate OTA in wheat flours were established, using multivariate
statistical techniques to define the main interfering in the extraction of OTA by the
QuEChERS method and detection in HPLC-FL. The validated method allowed the
evaluation of the naturally occurring on 20 wheat flour samples, these being contaminated
in the range of 0.22 to 0.85 µg.kg-1
, with a daily intake of 0.08 ngOTA.day-1
.kgbodyweight
-1
and a digestibility of 94.4%. Then standardization of carboxypeptidase A extraction on
Rhizopus oryzae biomass was carried out, which consisted of ultrasonic agitation for 30
minutes at 150 W and 40 kHz and the screening of biological agents to OTA degradation
were assessed. To study the in vitro degradation of OTA a method for extraction and
detection of OTA and OTα in HPLC-FL was validated and the degradation process was
performed with Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei, encountering a reduction of
63.5% and 57.7%, respectively. The degradation showed a high (R> 0.9) and significant
(p <0.05) correlation with Otα production, indicating that a enzyme capable of
hydrolyzing the mycotoxin was produced, for example, carboxypeptidase A. The study of
OTA and is metabolite OTα toxicity was performed on human neutrophils, where it was
observed the absence of OTα toxic effect. It was also determined OTA toxicity
mechanism by the increase in the intracellular Ca2+ release from internal stores. This
release subsequently triggers a cascade of events, namely: production of reactive species,
ATP depletion, ΔΨm loss, leading to death by necrosis. To reduce the risk of exposure to
mycotoxin by eating contaminated ray materials, carboxypeptidase A extracted from
different sources was applied to the hydrolysis of OTA on wheat flour for subsequent
determination of the residual content of OTA and OTα employing validated method. The
study showed an OTA decrease between 16.8% and 78.5 and OTα production from 2 to
8.2 ng.g-1
. The most promising carboxypeptidases for degradation were obtained from
Rhizopus and Trichoderma, and the commercial carboxypeptidase. It was shown that it
may be recommend the use of proteolytic enzymes, type carboxypeptidase, to reduce the
risk of exposure to mycotoxin when contaminated raw material is used, for example,
wheat flour for different processes. The transformation of OTA to OTα and its effect in
reducing the mycotoxin toxicity corroborate with this statement.
Este trabalho teve como objetivo estabelecer uma abordagem inovadora para avaliar os efeitos da composição de cereais na extração de ocratoxina A por análise multivariada e aplicar o método validado para estimativa de risco de exposição à ocratoxina A pelo consumo de farinhas de trigo. A análise de componentes principais (ACP) foi aplicada para comprovar o efeito de componentes majoritários da matriz na recuperação de ocratoxina A pelo método QuEChERS em CCD e CLAE e para validar o método para determinação de ocratoxina A em farinhas por CLAE. As matrizes utilizadas, farelo de arroz, de trigo e farinha de trigo foram caracterizadas físico-quimicamente. A recuperação de OTA nessas matrizes foi altamente influenciada (R=0,99) pelo conteúdo de açúcares presente nas matrizes, tendo como menor interferente o conteúdo lipídico (R=0,29). A partir desses resultados, o método QuEChERS foi padronizado para extração de OTA utilizando ACN 1%:água (7:3) como solvente extrator e como sais, sulfato de magnésio seco e cloreto de sódio. Os valores de recuperação variaram de 97,6 a 105%. O método validado permitiu a avaliação da ocorrência natural de 20 amostras de farinha de trigo, estando estas contaminadas na faixa de 0,22 a 0,85 µg.kg-1 , apresentando um valor de ingestão diária de 0,08 ngOTA.dia-1 .kgmassacorpórea -1 e uma disponibilização de 94,4%.
Micotoxinas são produzidas por fungos filamentosos em diferentes etapas da cadeia produtiva de alimentos, destacando-se a ocratoxina A (OTA) por seus efeitos nefrotóxicos, carcinogênicos e teratogênicos. O desenvolvimento de métodos capazes de diminuir esta contaminação a níveis permitidos pela legislação são incentivados e os processos biológicos, envolvendo o uso de enzimas e microrganismos para degradação da OTA são preferenciais pela especificidade e condições brandas de detoxificação. Neste trabalho, foram estabelecidas condições de extração de carboxipeptidase A a partir de biomassa fermentada por Rhizopus oryzae para empregá-la na degradação de OTA, tendo a pancreatina como controle. O método padronizado para extração enzimática consistiu em agitação ultrassônica durante 30 minutos numa potencia fixa de 150 W e 40 kHz. O extrato enzimático do microrganismo degradou 19,4% sendo 49% superior quando comparado com a pancreatina. Ficou demonstrada a vantagem da utilização de enzimas microbianas para processos de degradação de micotoxinas.
