Determinação simultânea multiclasse de micotoxinas em cerveja

Abstract

As micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos filamentosos toxigênicos que podem contaminar diversos alimentos, entre eles a cevada que é utilizada como principal matéria-prima para a produção de cerveja. A contaminação da cerveja pode ser ocasionada devido a transferência de micotoxinas presente nas matérias-primas utilizadas para a fabricação da bebida que possuem características como termoestabilidade e solubilidade em água, o que ocasiona a contaminação do fermentado final devido as micotoxinas presentes na matéria-prima. O objetivo desse trabalho foi desenvolver e otimizar um método para análise de tricotecenos, AFLAS, OTA e ZEA em cervejas comerciais e correlacionar a contaminação dessas micotoxinas com alterações nas propriedades físico-químicas e bioquímicas das amostras. A extração dos tricotecenos, OTA e ZEA foi realizado através do método QuEChERS otimizado e a determinação foi realizada por cromatografia de alta eficiência (CLAE) acoplada a um detector ultravioleta (UV). A extração das AFLAS foi realizada através do método de partição líquido-líquido (PLL) otimizado e a determinação foi realizada por CLAE acoplada a um detector de fluorescência (FL). Para garantir a confiabilidade do método foram avaliadas a exatidão, precisão, linearidade e limites de detecção e quantificação de ambos os métodos, que tiveram resultados de acordo com a exigência dos ensaios de exatidão por recuperação (70-120%) e precisão (RSD<20%). Como resultado da otimização do método QuEChERS, 10 mL de amostra foi utilizada com 10 mL de ACN em agitador orbital (150 rpm), após é adicionado 1g de NaCl e 4g de MgSO4 para separar as fases. Como etapa de clean up foi adicionado 0,3 g de celite e 0,9 g de MgSO4. Para a extração das AFLAS pelo método de PLL 10 mL de amostra e 3 mL de diclorometano foram transferidos a um erlenmeyer de 250 mL em agitador orbital (150 rpm), logo após passou por uma etapa de centrifugação e recolhimento da fase orgânica, repetindo o procedimento 3 vezes no total. Das 31 amostras analisadas todas apresentaram contaminação para pelo menos uma das micotoxinas analisadas, como DON (0,3-52,8 μg.L-1), ADONS (1,35-3,14 μg.L-1), ZEA (0,03-3,64 μg.L-1), Toxina T-2 (1,33-17,95 μg.L-1), NIV (0,54-2,5 μg.L-1), OTA (2,04-8,4 ng.L-1), AFB1 (2,92-9,22 ng.L-1), AFB2 (0,12-0,43 ng.L-1) e AFG2 (1,3-1,57 ng.L-1). Após a quantificação das amostras, essas foram separadas de acordo com as matérias que foram fabricadas para fazer a correlação entre as principais variáveis físico-químicas e bioquímicas que foram alteradas devido a contaminação de micotoxinas nas amostras. As correlações geradas apontaram principalmente a influência do processo de moagem da cevada na alteração das propriedades físico-químicas, assim como o aumento de micotoxinas. A correlação entre a adição de carboidratos de origem vegetal como amido de milho ou xarope de cereais com as micotoxinas foi verificada, indicando que a adição desses produtos aumenta o risco de contaminação por micotoxinas, pois há relação entre o teor dessas toxinas com açúcares redutores. Algumas micotoxinas apontaram correlações com os parâmetros bioquímicos analisados, indicando que a contaminação pode ocasionar um estresse na levedura e modificar a produção dessas biomoléculas.

Mycotoxins are secondary metabolites produced by toxigenic filamentous fungi that can contaminate various foods, including barley that is used as the main raw material for brewing. The contamination of the beer can be caused due to the transfer of mycotoxins present in the raw materials used for the beverage that have characteristics such as thermostability and solubility in water, which causes the contamination of the final fermentation due to the mycotoxins present in the raw material. The objective of this work was to develop and optimize a method for the analysis of trichothecenes, AFLAS, OTA and ZEA in commercial beers and to correlate the contamination of these mycotoxins with changes in the physicochemical and biochemical properties of the samples. The extraction of trichothecenes, OTA and ZEA was performed using the optimized QuEChERS method and the determination was performed by high performance chromatography (HPLC) coupled to an ultraviolet (UV) detector. The AFLAS extraction was performed using the optimized liquid-liquid partition method (PLL) and the determination was performed by HPLC coupled to a fluorescence detector (FL). In order to guarantee the reliability of the method, the accuracy, precision, linearity and limits of detection and quantification of both methods were evaluated according to the requirement of accuracy of recovery (70-120%) and accuracy (RSD < 20%). As a result of the optimization of the QuEChERS method, 10 mL of sample was used with 10 mL of ACN in an orbital shaker (150 rpm), after adding 1 g of NaCl and 4 g of MgSO4 to separate the phases. As a cleaning step 0.3 g of celite and 0.9 g of MgSO4 were added. For the extraction of the AFLAS by the PLL method 10 mL of sample and 3 mL of dichloromethane were transferred to a 250 mL erlenmeyer on orbital shaker (150 rpm), after a centrifugation step and organic phase recovery, repeating the procedure 3 times in total. From the 31 analyzed samples all presented contamination for at least one of the mycotoxins analyzed, DON (0,3-52,8 μg.L-1), ADONS (1,35-3,14 μg.L-1), ZEA (0,03-3,64 μg.L-1), Toxin T-2 (1,33-17,95 μg.L-1), NIV (0,54-2,5 μg.L-1), OTA (2,04-8,4 ng.L-1), AFB1 (2,92-9,22 ng.L-1), AFB2 (0,12-0,43 ng.L-1) and AFG2 (1,3-1,57 ng.L-1. After the quantification of the samples, they were separated according to the materials that were manufactured to correlate the main physico-chemical and biochemical variables that were altered due to the contamination of mycotoxins in the samples. The correlations generated mainly indicated the influence of the barley milling process on the alteration of physicochemical properties, as well as the increase of mycotoxins. The correlation between the addition of carbohydrates of plant origin as corn starch or cereal syrup with mycotoxins was verified, indicating that the addition of these products increases the risk of contamination by mycotoxins, since there is a relationship between the content of these toxins with reducing sugars. Some mycotoxins showed correlations with the biochemical parameters analyzed, indicating that the contamination can cause a stress in the yeast and modify the production of these biomolecules.