Abstract:
A enzima b-galactosidase pode ser encontrada na natureza, distribuída entre vegetais, em órgãos de animais e também ser produzida por grande quantidade de microrganismos, tais como fungos filamentosos, bactérias e leveduras. A importância industrial da b-galactosidase está na sua aplicação na indústria de laticínios. Esta enzima hidrolisa a lactose, carboidrato característico do leite em seus
monossacarídeos glicose e galactose, melhorando a solubilidade e digestibilidade do leite e derivados lácteos, ideais para consumidores intolerantes à lactose. A b-
galactosidase é muito produzida por leveduras do gênero Kluyveromyces, sendo uma enzima intracelular. A purificação da b-galactosidase constitui uma etapa complexa do
processo, pois para produtos intracelulares é necessário efetuar o rompimento celular,
causando aumento da viscosidade ampliando a diversidade de contaminantes, necessitando de muitas etapas de purificação para remover a enzima desejada, o que aumenta o custo do processo e reduz o seu rendimento. O sistema aquoso bifásico(SAB) é uma alternativa para o primeiro passo de purificação, por remover vários contaminantes em um processo simples e econômico. Os processos de separação por membrana (PSM), como a ultrafiltração, são uma alternativa entre os processos de separação existentes para recuperar, concentrar e até purificar macromoléculas.
Estes processos oferecem vantagens como a possibilidade de separação dos produtos e operação em temperaturas brandas, o que os torna adequados para separação de compostos termolábeis como as enzimas. A partir disto este trabalho teve por objetivo estudar a purificação da enzima b-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 utilizando a técnica de sistema aquoso bifásico (SAB) e
ultrafiltração, determinando as condições de purificação, considerando a pureza e o
rendimento da enzima. Na purificação por SAB o sistema era formado por polietilenoglicol (PEG) e tampão fosfato de potássio, sendo avaliadas as variáveis pH (6,0; 7,0; 8,0) e massa molar de PEG (300, 1500, 4000, 6000, 8000 e 10000). A melhor das condições obtida foi com fator de purificação da b-galactosidase de 10,1 vezes e recuperação de 175,2% na fase de fundo do SAB utilizando PEG 8000 no pH 8,0. Testes de ultrafiltração foram realizados a fim de selecionar a massa molar de corte (10, 50 e 60 KDa) de uma membrana comercial mais adequada ao processo, na qual permitisse a passagem da menor quantidade de enzima para o permeado, o que
foi quantificado por medidas de atividade enzimática e do teor de proteína na
alimentação e no permeado após cada teste. Para o fracionamento com membranas foi utilizado o sistema pH 6,0 e a temperatura entre 5-10 ºC em pressão manométrica de 147,1 KPa em uma célula de ultrafiltração tipo “dead-end” com agitação magnética. A membrana de massa molar de corte de 50 KDa foi a que apresentou melhores resultados, permitindo uma recuperação de 66,3% e fator de concentração de 7,6 vezes. Foi avaliada a variação de pH (6,0; 7,0; 8,0) e adição de NaCl à solução de alimentação contendo a enzima utilizando a membrana de 50 KDa selecionada anteriormente. Através dos resultados obtidos, foi verificado que mudanças no pH e na força iônica da solução enzimática não levaram a melhoria na separação.
The enzyme b-galactosidase can be found in the nature, distributed among vegetables,
in organs of animals and they are also produced by a great amount of microorganisms,
such as filamentous fungi, bacteria and yeasts. The industrial importance of the -
galactosidase is in its application in the dairy industry. This enzyme hydrolyzes the
lactose, the characteristic carbohydrate of the milk, in their monossacarides glucose
and galactose, improving the solubility and digestibility of the milk and milk-based
products, what is ideal for consumers intolerant to lactose. The b-galactosidase is
highly produced by the yeast genus Kluyveromyces, being an intracellular enzyme. The purification of the b-galactosidase constitutes a complex stage of the process, because for intracellular products it is necessary to break the cells, causing an increase in the viscosity and in the diversity of contaminants. This increase the need for many purification steps for removing the desired enzyme, what increases the cost of the process and reduces its yield. The aqueous two-phase system (ATPS) is an alternative for the first step of purification, since it can remove many contaminants in a simple and economical process. The membrane process (MP), such as ultrafiltration, is an alternative to the existing processes of separation to recover, concentrate and even purify macromolecules. These processes offer advantages as the separation of the products and operation at mild temperatures, which makes this process suitable for heat sensitive compounds, as enzymes. This work aimed to study the purification of the enzyme b-galactosidase produced by Kluyveromyces marxianus CCT 7082 using aqueous two-phase systems (ATPS) and ultrafiltration, determining the purification
condictions and considering the purity and the yield of the enzyme. In the purification
using ATPS, the system consisted in polyethyleneglycol (PEG) and potassium
phosphate buffer. The pH (6.0; 7.0; 8.0) and molecular weight of PEG (300, 1500, 4000, 6000, 8000 and 10000) were evaluated. The best factor of purification of b-
galactosidase was 10.1-fold and recovery of 175.2% in the top phase of ATPS using
PEG 8000 at pH 8.0. Ultrafiltration tests were carried out to more select the most
suitable molecular weight cut off (10, 50 and 60 KDa) of commercial membranes, which allowed the permeation of the least amount of enzyme to the permeate. The enzymatic activity and the protein content in the feed and permeate were measured in each test. The permeation runs were carried out at pH 6.0 and at 5-10 ºC, in a feed manometric pressure of 147.1 KPa, using a dead-end stirred ultrafiltration cell. The membrane wit MWCO of 50 KDa was the one that presented the best results. yielding a 66.3% recovery and a concentration factor of 7.6. The variation in pH from 6.0 to 8.0 and the addition of NaCl to the feed solution cotaining the enzyme were assessed. The results showed that the changes in pH and ionic strength did not influence separation performance, showing the efficiency of the ultrafiltration process in the recovery and concentration of the enzyme.
