Purificação de ficocianina de Spirulina platensis através de sistema aquoso bifásico e caracterização cinética da desnaturação térmica

Abstract

A microalga Spirulina platensis apresenta em sua biomassa compostos de alto valor agregado como a ficocianina, um pigmento azul usado como corante natural na indústria alimentícia e de cosméticos e de grande interesse na indústria farmacêutica devido as suas propriedades terapêuticas, fatos estes que tornam sua obtenção com alto grau de pureza e sua caracterização uma possibilidade atraente. A presente dissertação teve como objetivos estudar e otimizar o processo de purificação do extrato aquoso de ficocianina de Spirulina platensi, com e sem células, por Sistema Aquoso Bifásico (SAB) polietilenoglicol (PEG)/fosfato de potássio variando-se a massa molar do polímero, 1500, 4000, 6000 ou 8000 Da, assim como estudar a cinética de desnaturação térmica do extrato aquoso de ficocianina, avaliando sua estabilidade entre 50 e 65°C para valores de pH entre 5 e 7 e estabelecer o modelo cinético para cada uma das situações propostas. Verificou-se que o pH 6 proporcionou a melhor purificação da ficocianina que se concentrou na fase de topo, rico em PEG, em todos sistemas estudados. A análise de efeitos, realizada através de quatro planejamentos fatoriais completos (22 ensaios + 3 pontos centrais), evidenciou que o aumento do percentual de sal causou um incremento no fator de purificação e o inverso ocorreu para o percentual de PEG. A otimização do processo de purificação através de quatro planejamentos fatoriais completos tipo delineamento central composto rotacional (DCCR) (22 ensaios + 4 pontos axiais + 3 pontos centrais) estabeleceu que os SABs compostos por PEG 1500 e 8000 e fosfato de potássio, com 7 e 23% e 4 e 22,5%, respectivamente, atingiram fatores de purificação máximos de 1,6 vezes para a ficocianina, com recuperação total da proteína no primeiro e de 57% no segundo e que os formados pelos PEG 4000 e 6000, compostos ambos por 4% de polímero e 21% de sal, alcançaram fatores de purificação de 2,1 e 2,2 vezes, recuperando 100 e 73,5% da proteína-alvo. A extração e a purificação da ficocianina em SAB polietilenoglicol/fosfato de potássio pH 6 integrando essas duas etapas, composto pelo PEG 1500 alcançou valores de pureza para a ficocianina superiores aos obtidos com o sistema convencional, em todos os percentuais estudados, enquanto que para o PEG 6000, as purezas da proteína alcançadas nos ensaios do sistema convencional foram todas superiores às obtidas no outro. Os sistemas integrados compostos por 15% de PEG 1500 e 13% de fosfato de potássio e 5% de PEG 4000 e 18% de sal, alcançaram, nessa ordem, 0,73 e 0,79 de pureza (A620/A280), valores estes que classificam esta ficobiliproteína como de grau alimentar, superior a 0,7. As concentrações de ficocianina obtidas nas fases de topo desses dois sistemas respectivamente, 2,67 e 1,60 mg.mL-1, evidenciam que o sistema composto pelo PEG 4000 foi mais eficiente que os demais pois alcançou a maior pureza conjugada a maior concentração da proteína. Para a caracterização cinética da desnaturação térmica da ficocianina, o modelo foi assumido como de primeira ordem e entre 50 e 55°C, o extrato aquoso de ficocianina foi mais estável a pH 6 e entre 57 e 65°C em pH 5, sendo então, na faixa de temperaturas estudadas, mais instável a pH 7. As energias de ativação para os extratos de ficocianina foram de 87,36, 135,57 e 111,14 kcal/gmol, para os valores de pH 5, 6 e 7. A adição do agente estabilizante sorbitol, entre 10 e 50% ampliou o tempo de meiavida, provando que a descoloração da ficocianina é relacionada com a desnaturação da cadeia protéica e, através de testes estatísticos de diferença de médias, pode-se definir que ao final de 40 minutos de tratamento térmico, o extrato de ficocianina de pH 5 manteve cerca de 80% de sua concentração média relativa com adição de 30% (p/p) de sorbitol, para o pH 6, com 40% (p/p) de agente estabilizante, a concentração foi mantida em cerca de 86% e para o pH 7, a partir de 10 minutos, todas as concentrações de sorbitol adicionadas ocasionaram concentrações médias relativas de ficocianina diferentes significativamente e com 50% (p/p) de sorbitol 85% da concentração da proteína se manteve.

Spirulina platensis microalgae presents in its biomass high added value compounds like phycocyanin, a blue pigment used as a natural colorant in the food and cosmetic industry also of great interest in the pharmaceutical industry due to its therapeutic properties. These facts make obtaining it with a high purity level and its characterization an attractive possibility. The present paper aimed at studying and optimizing the purification process of the phycocyanin aqueous extract from Spirulina platensis with and without cells through aqueous two-phase systems (ATPS) polietilenoglicol (PEG)/potassium phosphate by varying the polymer molar mass, 1500, 4000, 6000 or 8000 Da, as well as studying the thermal denaturization kinetics of the phycocyanin aqueous extract by evaluating its stability between 50 and 65°C for pH values between 5 and 7 and establishing the kinetic model for each proposed situation. It was verified that the pH 6 provided the best phycocyanin purification which was concentrated in the top phase in all the studied systems. The effect analysis done for the four full factorial designs (22 trial plus + 3 central points), made clear that the increase of the salt percentage caused an increment in the purification factor and the inverse occurred for the PEG percentage. The optimization of the purification process through four full factorial design CCRD (22 trial + 4 axial points + 3 central points) established that the ATPS composed by PEG 1500 and 8000 and potassium phosphate, with 7 and 23% and 4 and 22.5%, respectively, reached maximum purification factors of 1.6 fold for the phycocyanin, with total protein recovery in the first and 57% in the second and that the ones formed by PEG 4000 and 6000, both composed by 4% of polymer and 21% of salt, reached purification factor of 2.1 and 2.2 fold, recuperating 100 and 73.5% of the target protein. The phycocyanin extraction and purification in SAB polyethylene glycol/potassium phosphate pH 6, integrating these two phases, composed by PEG 1500, reached purity values for phycocyanin higher than the ones obtained with the conventional system in all studied percentages, while for PEG 6000, all protein purities obtained in the conventional system trials were higher than the ones obtained in the other. The integrated systems composed by 15% of PEG 1500 and 13% of potassium phosphate and 5% of PEG 4000 and 18% of salt, reached, in this order, 0.73 and 0.79 of purity (A620/A280). These values classify this phycobiliprotein as of food grade, higher than 0.7. The concentrations of phycocyanin obtained in the top phases of these two systems, respectively, 2.67 and 1.6 mg.mL-1, make clear that the system composed by PEG 4000 was more efficient than the others because it reached the biggest purity along with to the highest protein concentration. For the kinetic characterization of the phycocyanin thermal denaturization, the model was assumed as of first order and, between 50 and 55°C, the phycocyanin aqueous extract was more stable at pH 6 and between 57 and 65°C at pH 5, thus, being more stable at pH 7 for the ranges of temperature studied. The activation energy for the phycocyanin extracts were 87.36, 135.57 and 111.14 Kcal/gmol for pH 5, 6 and 7 values. The addition of the sorbitol stabilizing agent between 10 and 50% increased the half-life, proving that the phycocyanin discoloration is related to the denaturization of the protein chain and, through statistical tests of average differences, it is possible to define that, at the end of 40 minutes of thermal treatment, the pH 5 phycocyanin extract kept about 80% of its relative average concentration with the addition of 30% (w/w) of sorbitol, for pH 7, with 40% (w/w) of stabilizing agent, the concentration was kept at about 86% and for pH 7, from 10 minutes on, all the sorbitol concentrations added caused significantly different phycocyanin relative average concentrations and with 50% (w/w) of sorbitol, 85% of the protein concentration was kept.