Abstract:
A beta-galactosidase é uma enzima utilizada industrialmente na hidrólise da lactose do leite gerando derivados lácteos destinados a pessoas intolerantes a este açúcar. Sua importância é salientada por sua atividade de galactosiltransferase, responsável pela síntese de galactooligosacarídeos, compostos com propriedades prebióticas. Quando produzida por leveduras do gênero Kluyveromyces, esta enzima é intracelular. Tendo em vista que as etapas de purificação, principalmente quando aplicadas a produtos intracelulares, são responsáveis por grande parte dos custos de produção, é importante estudar técnicas que possam ser aplicadas diretamente ao extrato bruto. A presente dissertação teve como principal objetivo estudar a adsorção e purificação da enzima beta-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 através de cromatografia de troca iônica. A enzima foi produzida por fermentação submersa em frascos agitados a 30 °C, 180 rpm por 96 horas. Primeiramente foi avaliado o uso de diferentes relações biomassa:solvente na extração da enzima utilizando ondas ultrassônicas. Foram testadas relações de 2,62 a 50 mg.mL-1, avaliando a resposta em termos de atividade enzimática e rendimento de extração. Em seguida foi determinada a estabilidade da enzima quanto à temperatura e pH. No estudo da estabilidade à temperatura, a enzima foi incubada a -18°C, 4°C, 10°C e 25°C. A estabilidade ao pH foi avaliada para valores entre 4,6 e 8,6, nas temperaturas de 37°C, 25°C, 10°C e 4°C. A atividade residual foi acompanhada ao longo do tempo. A adsorção da enzima pela resina aniônica Q Sepharose Fast FlowTM foi estudada a 4°C e 10°C e em pH de 6,5 a 7,5, através de ensaios cinéticos em reatores agitados contendo a enzima e a resina, a 200 rpm por 360 minutos, onde foram determinados os coeficientes de partição da enzima no equilíbrio para cada condição. A capacidade de adsorção da resina, nas velocidades de alimentação da enzima de 20 cm.h-1 e 40 cm.h-1, foi determinada através da construção de curvas de ruptura em coluna de leito fixo do tipo C10/20. Na purificação da enzima foi avaliado o efeito das variáveis pH de eluição e volume necessário para o gradiente linear salino. Para isso, foi utilizado um planejamento experimental onde o pH variou de 5,5 a 7,5 enquanto que o volume para o gradiente salino variou de 10 a 30 vezes o volume de leito. Na etapa de concentração da enzima beta-galactosidase, a melhor condição foi o uso de uma suspensão celular contendo 40 mg.mL-1, a qual proporcionou uma atividade de 42 U.mL-1. A enzima foi mais estável nas temperaturas de 10°C e 4°C, para a faixa de pH de 6,6 a 8,6. A maior adsorção da enzima pela resina de troca iônica ocorreu em pH 7,5 e temperatura de 10°C, obtendo-se um coeficiente de partição de 61,2, assim como utilizando velocidade superficial de alimentação de 20 cm.h-1 expressa pelo valor de q igual a 104,4 U.mL-1. Foi possível obter e validar um modelo empírico linear para descrever o processo de purificação da enzima por cromatografia de troca iônica em termos de rendimento e fator de purificação. A melhor condição para purificação da beta galactosidase foi pH de eluição de 5,5 e volume para o gradiente linear salino igual a vinte vezes o volume de leito, obtendo-se rendimento de 85,5% e fator de purificação de 12 vezes.
The beta-galactosidase is an enzyme industrially used in the hydrolysis of milk lactose, generating dairy products destined to people intolerant to this sugar. Its importance is pointed out by its galactosiltransferase activity, responsible for galactooligosaccharide synthesis, compounds with prebiotic properties. When produced by yeasts of the Kluyveromyces gender, this enzyme is intracellular. Considering that the purification steps, mainly when applied to intracellular products, are responsible for great part of the production costs, it is important to study techniques that can be directly applied to the crude extract. The present dissertation had as the main objective to study the adsorption and purification of the beta-galactosidase enzyme of Kluyveromyces marxianus CCT 7082 through ion exchange chromatography. The enzyme was produced by fermentation submerged in agitated flasks at 30 °C, 180 rpm for 96 hours. Firstly the use of different biomass:solvent ratios (from 2.62 to 50 mg.mL-1) in the extraction of the enzyme using ultrasonic waves was evaluated. The response in terms of enzymatic activity and extraction yield was assessed. The stability of the enzyme in relation to the temperature and pH was them determined. In the study of the stability to the temperature, the enzyme was incubated at -18°C, 4°C, 10°C and 25°C. The pH stability was evaluated between 4.6 and 8.6, at temperatures of 37°C, 25°C, 10°C and 4°C. The residual activity was followed along the time. The adsorption of the enzyme for the anionic resin Q Sepharose Fast Flow TM was studied at 4°C and 10°C and in pH from 6.5 to 7.5, through kinetic assays in agitated reactors containing the enzyme and the resin, at 200 rpm for 360 minutes, where the coefficients of partition of the enzyme at equilibrium for each condition was determined. The adsorption capacity q of the resin, at flow rate of enzyme extract of 20 cm.h-1 and 40 cm.h-1 , was determined through the construction of rupture curves in fixed-bed column of type C10/20. In the purification of the enzyme the effect of the elution variables pH and the necessary volume for the linear saline gradient was evaluated. Therefore, an experimental design was use, where the pH varied from 5.5 to 7.5, while the volume for the saline gradient varied from 10 to 30 times the bed volume. In the step of concentration of the enzyme beta-galactosidase, the best condition was the use of a cellular suspension containing 40 mg.mL-1, which provided an activity of 42 U.mL-1. the enzyme was more stable in the temperatures of 10°C and 4°C, for the pH range from 6.6 to 8.6. The largest adsorption of the enzyme for the ion exchange resin happened in pH 7.5 at 10°C, yielding a partition coefficient of 61.2, similar to that obtaining using flow rate of 20 cm.h-1, expressed by value of q similar to 104.4 U.mL-1. It was possible to obtain and to validate a linear model to describe the process of purification of the enzyme by chromatography of ionic change in terms of yield and purification factor. The best condition for purification of the beta-galactosidase was elution pH of 5.5 and volume for the linear saline gradient equal to twenty times the bed volume, obtaining a yield of 85,5% and purification factor of 12 times.
