Redução dos níveis de Ocratoxina A por ação da enzima peroxidase

Abstract

A ocratoxina A é um composto formado a partir do metabolismo secundário de fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. Uma vez que a presença dessa micotoxina nos alimentos causa sérios danos à saúde humana e animal, surge o interesse pelo desenvolvimento de métodos que visem a redução dos seus níveis em diferentes matrizes. Diversos processos de descontaminação têm sido propostos, sendo que os métodos de redução biológica tem recebido destaque. Esses métodos consistem na aplicação de micro-organismos ou de suas enzimas, o que gera a biotransformação ou degradação da toxina produzindo metabólitos com menor ou nenhuma toxicidade. Diante disso, o objetivo geral do trabalho foi avaliar o efeito da peroxidase na redução dos níveis de ocratoxina A. As enzimas peroxidases testadas foram a comercial e a obtida do farelo de arroz. Para a extração enzimática foram utilizadas as frações granulométricas do farelo de arroz de 48 a 100 mesh, sendo estas frações caracterizadas quimicamente. A peroxidase foi extraída do farelo de arroz em tampão 10 mM pH 5,0 e purificada por partição trifásica, obtendo 77,1% de recuperação e 9,2 para o fator de purificação. O método utilizado para a extração da ocratoxina A do sistema aquoso foi por partição líquido-líquido utilizando como solvente o clorofórmio, sendo esse método validado segundo os parâmetros de linearidade (0,1 a 20 ng mL-1), coeficientes de correlação (0,9997) e de determinação (0,9994), e limites de detecção (0,02) e quantificação (0,03). A afinidade entre as peroxidases e a ocratoxina A foi verificada segundo os parâmetros de KM e Vmáx, resultando em 0,00027 mM e 0,000015 mM min-1, respectivamente, para a peroxidase comercial, e 0,0065 mM e 0,000031 mM min-1 para a obtida do farelo de arroz. Com relação aos percentuais de redução de ocratoxina A, foram avaliadas 3 proporções enzima:substrato (1:10, 1:5 e 8:1 para a comercial e 1:10, 1:5 e a com atividade de 0,063 U mL-1 para a do farelo), sendo que as proporções que forneceram maior redução foi a de 8:1 para a enzima comercial (0,063 U mL-1) e a correspondente a 0,063 U mL-1 para a enzima obtida do farelo. Os percentuais de redução de ocratoxina A foram de 59% para a peroxidase comercial em 300 min e 41% para a peroxidase do farelo de arroz em 1440 min. O efeito de adsorção da ocratoxina A pela enzima peroxidase foi descartado uma vez que foi realizada a sua hidrólise com a enzima pepsina e verificado um percentual de 2,7% de adsorção, demonstrando que a redução foi por ação enzimática. A enzima obtida de farelo de arroz com atividade de 0,063 U mL-1 foi aplicada em suco de uva tinto e branco. Observou-se que para o primeiro não houve redução significativa, enquanto que para o segundo a redução foi de 17%. Neste trabalho, então, foi possível verificar a capacidade de redução dos níveis da ocratoxina A pela enzima peroxidase, tanto em sistema aquoso como no suco de uva integral branco.

Ochratoxin A is a compound formed by secondary metabolism of fungi from genera Aspergillus and Penicillium. The mycotoxin presence in food can cause serious damages to human and animal health. This aspect improves the interest in developing methods aimed at reducing their levels in different matrices. Several decontamination procedures have been proposed, and the biological reduction methods have been highlighted. These methods consist in the application of micro-organisms or their enzymes, which generates the biotransformation or degradation of the toxin producing metabolites with less or no toxicity. Thus, the overall objective of the study was to evaluate the effect of peroxidase in reducing ochratoxin A levels. The peroxidases enzymes tested were commercial and extracted from rice bran. For the enzyme extraction were used the particle size fraction 48 to 100 mesh of rice bran and this fraction was chemically characterized. The peroxidase was extracted from rice bran in buffer 10 mM pH 5.0 and purified by three-phase partitioning, yielding 77.1% of recovery and 9.2 for the purification factor. The ochratoxin A extraction method used was by liquid-liquid partition using chloroform as a solvent and this method was validated according to linearity (0.1 to 20 ng mL-1), correlation coefficient (0.9997) and coefficient of determination (0.9994) and limits of detection (0.02 ng mL-1) and quantification (0.03 ng mL-1). The enzymes and ochratoxin A affinity was found according to the parameters KM and Vmáx, resulting in 0.00027 mM and 0.000015 mM min-1, respectively, for commercial peroxidase, and 0.0065 mM and 0,000031 mM min-1 to rice bran enzyme. With respect to the percentage of ochratoxin A reduction, 3 proportion enzyme:substrate (1:10, 1: 5 and 8: 1 for commercial and 1:10, 1: 5 and with the activity of 0,063 U ml-1 for rice bran enzyme) were assessed. The proportion that provided the greatest reduction was 8:1 for the commercial enzyme (0.063 U mL-1) and corresponding to 0.063 U mL-1 enzyme from rice bran. The percentage reduction of ochratoxin A obtained was 59% for the commercial peroxidase at 300 min and 41% for the rice bran peroxidase at 1440 min. The adsorption effect of ochratoxin A by the enzyme peroxidase has been dropped since its hydrolysis was carried out with pepsin enzyme and verified a percentage adsorption of 2.7%, showing that the reduction was by enzymatic action. The rice bran enzyme with 0,063 U mL-1 activity was applied in red and white grape juice. For the first juice no significant reduction was observed, whereas for the second the reduction percentage obtained was 17%. In this work was possible to verify the capacity reduction of ochratoxin A levels by peroxidase enzyme in both aqueous system and the white grape juice.