Inibição de linhagens do complexo Fusarium Graminearum por compostos naturais e sintéticos

Abstract

Quando produtos alimentícios e especiarias são contaminados por micotoxinas é quase impossível detoxificar utilizando processos usuais da indústria de alimentos ou durante o preparo doméstico. Por isso, controlar o crescimento do fungo e a produção de toxinas é uma demanda para garantir a segurança alimentar. Os agrotóxicos são rotineiramente utilizados como estratégia para proteger as plantas de doenças provocadas pela contaminação fúngica. No entanto, eles estão associados a efeitos adversos ao sistema nervoso central e periférico, têm ação imunodepressora e são cancerígenos. Em virtude disso, o objetivo deste trabalho foi estudar a inibição do desenvolvimento, do potencial toxigênico e da expressão gênica de linhagens do Complexo Fusarium graminearum por compostos naturais comparativamente aos fungicidas azoxistrobina e trifloxistrobina. Do farelo de arroz, foram extraídos o γ-orizanol e os ácidos fenólicos (EFF). Das sementes de nim foram extraídos os ácidos fenólicos (EFN), totalizando três extratos naturais. A capacidade antioxidante dos extratos foi verificada pelo consumo do radical livre DPPH• , capacidade de captura do radical ABTS●+, redução do ferro e inibição da oxidação enzimática. Os mecanismos de inibição de três linhagens de F. graminearum foram avaliados através da determinação de compostos estruturais (glicosamina e ergosterol) e da atividade de enzimas do metabolismo primário (α- amilase e proteases). Foram determinadas as micotoxinas de Fusarium: deoxinivalenol (DON), 15 acetildeoxinivalenol (15AcDON), 3 acetildeoxinivalenol (3AcDON), nivalenol (NIV) e zearalenona (ZEA). A expressão dos genes Tri1 e Tri5 foi determinada a fim de verificar se ocorria modificação da expressão gênica nas linhagens do Complexo F. graminearum ocasionada pela presença dos antifúngicos. O EFF apresenta atividade antioxidante destacada em relação aos demais extratos naturais para inibir a iniciação do processo, a propagação do radical livre e a catálise enzimática. A presença dos compostos naturais mostrou efeito promissor como antifúngico para as linhagens, sendo que a concentração necessária para inibir 50% do crescimento radial das colônias (MIC50) foi 0,9 g/kg para γ-orizanol; 0,032 g/kg para EFF e 0,037 g/kg para EFN, portanto, os extratos fenólicos são mais eficazes para inibição de F. graminearum do que o γ-orizanol. Os extratos naturais afetaram as atividades das enzimas α-amilase e proteases. Também ocorreu a redução da formação de componentes estruturais (glicosamina e ergosterol). Os extratos naturais se destacaram pela capacidade de inibição de micotoxinas produzidas pela biomassa fúngica, com destaque para o EFN sobre a produção de DON, 15AcDON, 3AcDON e ZEA. Sendo assim, é possível dizer que há uma relação direta entre a atividade antioxidante na inibição do fungo e na manifestação do seu potencial toxigênico. Além disso, esse estudo contribuiu com a elucidação do mecanismo de ação dos antifúngicos naturais estudados. Ocorre modificação na expressão gênica quando a linhagem é submetida ao tratamento com antifúngico, havendo uma relação direta entre a expressão do gene Tri5 e a produção de DON.

When food products and spices are contaminated by mycotoxins is almost impossible to detoxify using usual processes of the food industry or during home preparation. Therefore, controlling the fungus growth and toxin production is a demand to ensure food safety. The pesticides are routinely used as a strategy to protect plants from diseases caused by fungal contamination. However, they are associated with adverse effects on the central and peripheral nervous system effects, have immunosuppressive action and are carcinogenic. As a result, the aim of this work was to study the inhibition of the development, toxigenic potential and gene expression of F. graminearum complex strains by natural compounds compared to azoxystrobin and trifloxystrobin fungicides. Of the rice bran were extracted the γ-oryzanol and phenolic acids (EFF). Of the neem seeds were extracted phenolic acids (EFN) totaling three natural extracts. The antioxidant activity of the extracts was measured by consumption of free radical DPPH•, ability to capture the radical ABTS●+, iron reduction and inhibition of enzymatic oxidation. The mechanisms of inhibition of three strains of F. graminearum were assessed by determining structural compounds (glucosamine and ergosterol) and activity of enzymes of the primary metabolism (α-amylase and protease). We determined the Fusarium mycotoxins: deoxynivalenol (DON), 15 acetildeoxinivalenol (15AcDON), 3 acetildeoxinivalenol (3AcDON), nivalenol (NIV) and zearalenone (ZEA). Expression of Tri1 and Tri5 genes was determined in order to verify if gene modification occurred in F. graminearum complex strains caused by the presence of antifungals. The EFF offers outstanding antioxidant activity compared to other natural extracts to inhibit the initiation of the process, the propagation of free radical and enzymatic catalysis. The presence of natural compounds showed promise as an antifungal effect to the strains, and the concentration required for 50% inhibition of radial growth of colonies (MIC50) was 0.9 g/kg for γ-oryzanol; 0.032 g/kg to EFF and 0.037 g/kg to EFN, thus, phenolic extracts are more effective for F. graminearum inhibition than γ-oryzanol. The natural extracts affected the α-amylase and protease activities. Also there was a reduction in the formation of structural components (glucosamine and ergosterol). The natural extracts stood out for its ability to inhibit mycotoxin produced by fungal biomass, especially the EFN on the production of DON, 15AcDON, 3AcDON and ZEA. Thus, is possible to say that there is a direct relationship between the antioxidant activity in fungus and in their toxigenic potential inhibition. Furthermore, this study contributed to the elucidation of the action mechanism of natural antifungals studied. Gene modification occurs when the strain is subjected to antifungal treatment, there is a direct relationship between the expression of Tri5 gene and DON production.

O γ-orizanol, um fitoquímico, tem atividade antioxidante e benefícios potenciais para saúde. Esse estudo objetivou desenvolver um método para extração de alta quantidade de γ-orizanol de farelo de arroz e verificar sua estabilidade em diferentes solventes. Dentre os cinco métodos estudados, o que teve maior rendimento em γ -orizanol foi melhorado, usando um delineamento composto central rotacional (DCCR - 2 4 , incluindo 8 experimentos no ponto axial e 4 no ponto central, totalizando 28 experimentos). As variáveis testadas foram temperatura, tempo, volume e proporção de hexano: isopropanol usados na extração. Elevado conteúdo de γ -orizanol (13,98 mg g-1 ) foi obtido quando as condições de extração foram 40°C, 40 min e 75 mL de hexano:isopropanol (1:3). Os limites de detecção e quantificação do método foram 0,9 μg g-1 e 3,1 μg g-1 , respectivamente. A precisão instrumental foi 0,004%, a repetibilidade (CVr) 9,4% e a recuperação 111,7 ± 17,7%. γ -orizanol é mais estável em isopropanol do que em hexano, onde 100% da concentração foi mantida após refrigeração por 72 dias.

Este trabalho teve como objetivo caracterizar fitoquímicos presentes no farelo de arroz (γ-orizanol e ácidos fenólicos) e nas sementes de nim (ácidos fenólicos) bem como verificar a capacidade antioxidante deles. O farelo de arroz e as sementes de nim foram caracterizados quanto a composição centesimal, pH e acidez. Do farelo de arroz, foram extraídos o γ-orizanol e os ácidos fenólicos (EFF). Das sementes de nim foram extraídos os ácidos fenólicos (EFN), totalizando três extratos naturais. Para caracterização do γ- orizanol, seus ácidos graxos foram identificados em GC-FID e seus componentes majoritários em HPLC-UV. Para a caracterização dos fenóis, os ácidos fenólicos do farelo de arroz e das sementes de nim foram determinados em HPLC-UV. A capacidade antioxidante dos extratos foi verificada pelo consumo do radical livre DPPH• , capacidade de captura do radical ABTS●+, redução do ferro e inibição da oxidação enzimática. A maior parte dos ácidos graxos do γ-orizanol foi insaturado (84%). Os componentes majoritários do γ-orizanol (cicloartenol ferulato, 2,4-metileno cicloartanol ferulato, campesteril ferulato, β-sitosteril ferulato) estão presentes na amostra e no padrão, confirmando a presença do γ-orizanol no extrato. Foram identificados e quantificados cinco ácidos fenólicos presentes nos extratos de farelo de arroz e sementes de nim, sendo o ácido gálico majoritário em ambos extratos. A quantidade de extrato necessário para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% (CE50) foi: 28,9 µg/mL para γ-orizanol; 2,1 µg/mL para EFF e 14,2 µg/mL para EFN. O extrato fenólico do farelo de arroz apresentou atividade antioxidante destacada em relação aos demais extratos naturais estudados.

Extratos vegetais podem interferir no ciclo de vida dos fitopatógenos por promover ou inibir seu desenvolvimento. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de γorizanol no desenvolvimento de Fusarium graminearum CQ244 e na manifestação do seu potencial toxigênico. Para isso, foi adaptado método de determinação simultânea de nivalenol (NIV), deoxinivalenol (DON) e zearalenona (ZEA) na biomassa fúngica. A ação antifúngica do γ-orizanol foi comparada aos fungicidas sintéticos azoxistrobina e trifloxistrobina. Em placas de Petri contendo meio batata dextrose ágar, foi adicionado γ-orizanol extraído de farelo de arroz em diferentes concentrações (0,1; 0,3; 0,5; 0,8, 1,0 e 1,2 g/kg) e também os fungicidas azoxistrobina (0,2 mg/kg) e trifloxistrobina (0,4 mg/kg). Discos de micélio de Fusarium graminearum CQ244 (0,5 cm) foram colocados nas superfícies dos meios solidificados e as culturas foram incubadas em estufa BOD (25°C, 7 dias). Foram realizadas determinações de glicosamina, ergosterol e medida do halo como indicativos do desenvolvimento fúngico. As micotoxinas NIV, DON e ZEA foram extraídas dos meios usando método QuEChERS e quantificadas usando HPLC/DAD. A inibição fúngica por γ-orizanol é maior que a proporcionada pelos fungicidas sintéticos, além de inibir a produção de NIV, DON e ZEA. O estudo dos compostos estruturais do fungo, além da medida do micélio, contribui para a compreensão do mecanismo de ação do γ-orizanol em relação aos fungicidas sintéticos.

Este trabalho teve como objetivo verificar a inibição do crescimento e do potencial toxigênico de linhagens do Complexo F. graminearum usando antifúngicos naturais (γorizanol, ácidos fenólicos de sementes de nim (EFN) e ácidos fenólicos de farelo de arroz (EFF)) ao longo de 30 dias, bem como verificar se havia modificação de expressão gênica das linhagens em presença dos extratos antifúngicos. Os fungicidas azoxistrobina e trifloxistrobina foram usados para fins de comparação. Os indicativos de desenvolvimento fúngico foram avaliados no 3°, 7°, 14°, 24°, 30° dias através da determinação de compostos estruturais da parede (glicosamina) e da membrana fúngica (ergosterol) e da atividade das enzimas α-amilase e proteases. Também foi avaliado o crescimento radial das colônias. As micotoxinas DON, 15AcDON, 3AcDON, NIV e ZEA foram extraídas dos meios usando método QuEChERS e quantificadas usando HPLC-UV/FL. A expressão dos genes Tri1 e Tri5 foi determinada por qPCR a fim de verificar a modificação na expressão das linhagens do Complexo F. graminearum ocasionada pela presença dos antifúngicos. Os compostos utilizados, naturais e sintéticos, promoveram a diminuição da atividade das enzimas hidroliticas do microorganismo. As inibições médias de α-amilase variaram entre 59% pelo γ-orizanol a 13% pelo azoxistrobina e de protease entre 56% pelo γ-orizanol a 28% pelo EFF. Os extratos fenólicos são mais eficientes e eficazes para inibição do F. graminearum do que o γorizanol. Além disso, os extratos naturais se destacam pela capacidade de inibição de micotoxinas produzidas pela biomassa fúngica, com destaque para o extrato fenólico do nim. Há relação direta entre a expressão do gene Tri5 e a produção de DON nas linhagens submetidas aos tratamentos com antifúngicos.