Produção e extração da enzima anidrase carbônica e de ficobiliproteínas a partir de microalgas

Abstract

Muito interesse tem sido focado no potencial biotecnológico das microalgas, principalmente devido à identificação de diversas substâncias sintetizadas por estes organismos, dentre elas a anidrase carbônica e as ficobiliproteínas. A anidrase carbônica é uma metaloenzima que catalisa a hidratação reversível do CO2 em bicarbonato com alta eficiência, sendo utilizada para captação de CO2 através de sistemas biológicos. A C-ficocianina e a aloficocianina, corantes naturais, são os dois principais componentes das ficobiliproteínas em cianobactérias e apresentam diversas aplicações dentro da indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica. O objetivo principal desta tese foi avaliar a produção e a extração da anidrase carbônica e das ficobiliproteínas a partir de diferentes microalgas. Para isso, primeiramente foi realizado uma investigação da produção da anidrase carbônica pela microalga Dunaliella tertiolecta, onde foi estudada a extração da enzima e sua aplicação em sistemas de captura enzimática de CO2. Posteriormente foi avaliada a produção da enzima ao longo do cultivo de diferentes microalgas marinhas e dulcícolas (Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis sueccica, Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata, Isochysis galbana, Chlorella vulgaris e Scenedesmus obliquus). A produção da enzima e de ficobiliproteínas, também, foi estudada para as cianobactérias Spirulina platensis LEB 52, Spirulina sp. LEB 18 e Synechococcus nidulans. Todos os cultivos foram acompanhados em termos de biomassa e pH. Por último, foi realizado um estudo de extração da enzima de P. tricornutum e extração conjunta da anidrase carbônica e de ficobiliproteínas da cianobactéria S. sp. LEB 18. Os cultivos foram realizados em frascos erlenmeyer contendo os meios Conway (marinhas), BG-11 (dulcícolas) e Zarrouk 20% (cianobactérias). Na avaliação da ruptura celular foram testadas as técnicas de maceração em gral e pistilo, agitação em vórtex com pérolas de vidro, sonicação com pérolas de vidro, homogeneizador ultrassônico, secagem, congelamento e descongelamento e a combinação de tratamentos. Maiores rendimentos de extração da enzima a partir da microalga D. tertiolecta foram obtidos utilizando tratamento ultrassônico, juntamente com baixas concentrações de biomassa úmida (0,1 e 0,2 g/L), e a mesma apresentou potencial para aplicação em processos de captação enzimática do CO2. Durante os cultivos, a microalga C. vulgaris se destacou como maior produtora da enzima anidrase carbônica, atingindo valores de atividade enzimática de 44,0 U/L. As cianobactérias apresentaram valores de atividade entre 41,6 e 45,9 U/L, sendo que a S. sp. LEB 18 foi a que apresentou maiores produções de C-ficocianina e aloficocianina no ponto de máxima atividade volumétrica, 65,9 e 82,2 µg/mL, respectivamente. A enzima extraída da biomassa de S. platensis LEB 52 catalisou a hidratação do CO2 que precipitou na forma de CaCO3. Maiores rendimentos de extração da enzima a partir das microalgas P. tricornutum e S. sp. LEB 18 foram obtidos utilizando homogeneizador ultrassônico, que foram 31,3 U/g e 25,5 U/g, respectivamente. A biomassa de S. sp. LEB 18, também apresentou potencial para a extração de ficobiliproteínas, obtendo- se altas concentrações de C-ficocianina (100,5 mg/g) e aloficocianina (69,9 mg/g). Através dos resultados obtidos, pode-se verificar a potencialidade das microalgas e das cianobactérias para produção da enzima anidrase carbônica e das ficobiliproteínas, biomoléculas de alto valor industrial. Este trabalho apresenta processos eficientes para a extração da enzima e de ficobiliproteínas tanto para escala laboratorial como industrial.

Much interest has been focused on the biotechnological potential of microalgae, mainly due to the identification of several substances, such as carbonic anhydrase and phycobiliproteins, which are synthesized by these organisms. Carbonic anhydrase is a metalloenzyme that catalyzes the reversible hydration of CO2 to from bicarbonate efficiently, is used for capturing CO2 in biological systems. Both C-phycocyanin and allophycocyanin, which are natural dyes and the majn components of phycobiliproteins in cyanobacteria, have been widely used in food, cosmetic and pharmaceutical industries. This thesis aimed at evaluating the production and extraction of carbonic anhydrase and phycobiliproteins from different microalgae. Firstly, an investigation of the carbonic anhydrase production by the microalga Dunaliella tertiolecta was carried out and the enzyme extraction and its application to CO2 enzymatic capture systems were studied. Secondly, the enzyme production was evaluated during cultivation of different marine and freshwater algae (Dunaliella tertiolecta, Tetraselmis sueccica, Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata, Isochysis galbana, Chlorella vulgaris and Scenedesmus obliquus). The enzyme and phycobiliprotein production by cyanobacteria Spirulina platensis LEB 52, Spirulina sp. LEB 18 and Synechococcus nidulans was also studied. Biomass and pH were monitored in all cultivations. Finally, a study of the enzyme extraction from P. tricornutum and of the combined extraction of carbonic anhydrase and phycobiliproteins from cyanobacteria S. sp LEB 18 was carried out. Cultivations were performed in Erlenmeyer flasks with the mediums Conway (marine), BG-11 (freshwater) and Zarrouk 20% (cyanobacteria). For the evaluation of cell disruption, the following techniques were tested: mortar and pestle maceration, agitation with glass beads, sonication with glass beads, ultrasonic homogenizer, drying, freezing and thawing and a combination of treatments. The highest extraction yields of the enzyme from the microalga D. tertiolecta were obtained by ultrasonic treatment with low concentrations of wet biomass (0.1 and 0.2 g/L), and the enzyme showed potential for application in enzymatic processes of CO2 capture. During the cultivations, the microalga C. vulgaris stood out as the greatest producer of the carbonic anhydrase enzyme since its values of enzyme activity reached 44.0 U/L. The cyanobacteria reached values of activity between 41.6 and 45.9 U/L, whereas S. sp. LEB 18 had the highest yields of C-phycocyanin and allophycocyanin at the point of maximum volumetric activity, 65.9 and 82.2 mg/mL, respectively. The enzyme from S. platensis LEB 52 catalyzed the hydration of CO2 that precipitate as CaCO3. The highest yields of enzyme extraction from the microalgae P. tricornutum and S. sp. LEB 18 were obtained by using an ultrasonic homogenizer; they were 31.3 U/g and 25.5 U/g, respectively. The biomass of S. sp. LEB 18 also had potential for the phycobiliprotein extraction and got high concentrations of C- phycocyanin (100.5 mg/g) and allophycocyanin (69.9 mg/g). Results show the potential of microalgae and cyanobacteria for the production of the carbonic anhydrase enzyme and phycobiliproteins, valuable biomolecules in industries. This paper describes efficient processes for the extraction of the enzyme and phycobiliproteins on both laboratory and industrial scales.