Ruptura celular, extração e encapsulamento de Astaxantina de Haematococcus pluvialis (Volvocales, Chlorophyta)

Abstract

O interesse na produção de astaxantina de fontes naturais vem aumentando significativamente, devido principalmente à sua capacidade como potente agente antioxidante. Na obtenção da astaxantina por via biotecnológica, a microalga Haematococcus pluvialis é um dos micro-organismos industrialmente mais interessantes. Entretanto, como a maioria dos carotenoides, a astaxantina é uma molécula altamente insaturada que pode ser facilmente degradada por processos térmicos. Em função desta instabilidade, uma possibilidade que se abre, a fim de proteger sua atividade biológica de fatores ambientais e reforçar a sua estabilidade física, é o encapsulamento. Neste sentido, este trabalho vem contribuir em inovações relacionadas ao desenvolvimento de tecnologia para ruptura celular, extração e nanoencapsulamento de astaxantina produzida por via biotecnológica, mais especificamente de astaxantina obtida através do cultivo de H. pluvialis. Neste estudo, os cultivos foram realizados em meio BBM e acetato de sódio e conduzidos a temperatura constante de 25±1 ºC em fotobiorreatores de 1 L com aeração por borbulhamento de ar de 300 mL.min-1 , agitação manual diária e sob iluminância constante de 444 µmol fótons.m-2 s -1 durante 15 dias, sendo inoculados com suspensão de microalgas previamente preparada, na proporção de 10%, e pH ajustado em 7,0. A biomassa foi recuperada dos cultivos por centrifugação e seca a 35 °C por 48 h. Em seguida, foram empregadas diferentes técnicas de ruptura celular (química, mecânica e enzimática). Após a ruptura, foi realizada a extração dos carotenoides e a quantificação dos carotenoides totais (µg.g-1 ) e da extratibilidade (%). Entre os solventes testados no método de ruptura química, o diclorometano foi o selecionado para a extração dos pigmentos carotenoides. Dentre as técnicas mecânicas de ruptura celular, a maceração da biomassa congelada com terra diatomácea resultou na maior extratibilidade e carotenoides totais (66,01% e 972,35 μg.g-1 ). A melhor condição de lise da parede celular de H. pluvialis, utilizando o preparado enzimático Glucanex® , ocorreu em pH do meio reacional de 4,5 a 55 ºC, com atividade inicial de β-1,3-glucanase de 0,6 U.mL-1 e um tempo de reação de 30 min, alcançando-se 17,73% de atividade lítica relativa. Nestas condições, com a reação enzimática assistida por ultrassom sem congelamento prévio da biomassa, atingiu-se 83,90% e 1235,89 µg.g -1 , respectivamente, para extratibilidade e carotenoides totais. Dentre as técnicas combinadas testadas, a maceração com terra diatomácea associada à lise enzimática apresentou valores de extratibilidade e carotenoides totais de, respectivamente, 93,83% e 1382,12 µg.g-1 . No encapsulamento do extrato contendo astaxantina obtido por lise enzimática associada por ultrassom, envolvendo a coprecipitação com PHBV (poli(3-hidroxibutirato-cohidroxivalerato)) em fluidos supercríticos, o aumento da pressão tendeu a reduzir o diâmetro da partícula formada, enquanto que o aumento da relação biomassa contendo astaxantina:diclorometano usada na etapa de extração incrementou o percentual de encapsulamento e a eficiência de encapsulamento para ambas pressões testadas (80 e 100 bar). Os maiores valores de percentual de encapsulamento (17,06%) e eficiência de encapsulamento (51,21%) foram obtidos nas condições de 80 bar e relação biomassa:diclorometano de 10 mg.mL -1 . Nestas condições, o diâmetro médio de partícula foi de 0,228 µm. Com base nos resultados obtidos, técnicas para a obtenção de astaxantina de H. pluvialis e seu encapsulamento foram desenvolvidas com sucesso, podendo ser extendidas a outros produtos intracelulares de microalgas.

The interest in the production of astaxanthin from natural sources has increased significantly, mainly due to its capacity as a powerful antioxidant. In the biotechnological production of astaxanthin, the microalgae Haematococcus pluvialis is one of the industrially most interesting microorganisms. However, as most of the carotenoids, astaxanthin is a highly unsaturated molecule and can be easily degraded by thermal processes. In function of this instability, in order to protect its biological activity of environmental factors and enhance their physical stability, the encapsulation is a possibility to avoid damages. Thus, this work contributes with innovations in the development of technologies related to cell rupture, extraction and nanoencapsulation of astaxanthin produced by biotechnological methods, more specifically astaxanthin obtained in the cultivation of H. pluvialis. In this study, the cultivation was performed using BBM and sodium acetate medium and performed at a constant temperature of 25±1 °C in photobioreactors of 1 L with aeration of 300 ml.min -1 , daily manual agitation and under constant illuminance of 444 μmol fotons.m-2 s -1 for 15 days, inoculated with a previously prepared suspension of microalgae, corresponding to 10%, and pH adjusted to 7.0. The biomass was recovered from cultures by centrifugation and dried at 35 °C for 48 h. In sequence, different techniques of cell disruption were employed (chemical, mechanical and enzymatic). After the rupture, it was performed the extraction of carotenoids, and total carotenoids (μg.g-1 ) and extractability (%) were determined. Among the solvents tested in chemical rupture method, dichloromethane was selected for extraction of carotenoid pigments. Among the mechanical cell disruption techniques, maceration with diatomaceous earth with previous freezing of biomass resulted in the highest extractability and total carotenoid (66.01% and 972.35 μg.g-1 ). The best condition for enzymatic lysis of cell wall, using the enzymatic preparation Glucanex® , has occurred in pH 4.5 at 55 °C, with β-1,3-glucanase initial activity of 0.6 U.mL-1 and reaction time of 30 min. In these condictions, with enzymatic reaction assisted by ultrasound without previous freezing, it was reached 83.90% and 1235.89 μg.g-1 , respectively, for extractability and total carotenoid. Among the combined techniques, maceration with diatomaceous earth associated with enzymatic lysis showed values for extractability and total carotenoid of 93.83% and 1382.12 μg.g-1 , respectively. In the encapsulation of the extract containing astaxanthin produced by enzymatic lysis assisted by ultrasound, involving the coprecipitation with PHBV (poly (3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)) in pressurized fluids, the increase of pressure decreased the particle diameter, while the increase of biomass containing astaxanthin:dichoromethane ratio led to an increase of encapsulation percentage and encapsulation efficiency for both pressures (80 and 100 bar). The best values for encapsulation percentage (17.06%) and encapsulation efficiency (51.21%) were obtained with 80 bar and biomass:dichloromethane ratio of 10 mg.mL-1 . In these condictions, the mean diameter of the particles was 0.228 µm. Based on the results obtained, techniques for obtaining astaxanthin from H. pluvialis and their encapsulation have been successfully developed, may be extended to other intracellular products from microalgae.