Purificação de β-galactosidase: design do processo

Abstract

A β-galactosidase é uma enzima largamente encontrada na natureza, distribuída entre animais, vegetais e micro-organismos. É utilizada industrialmente na hidrólise da lactose de leite e derivados, principalmente em produtos destinados a pessoas que apresentam intolerância à lactose, ou seja, incapacidade de digerir a lactose pela deficiência ou ausência desta enzima. O aumento da demanda industrial de β-galactosidase implica na necessidade de métodos de produção que assegurem a viabilidade econômica da hidrólise de lactose em escala comercial. Portanto, tornamse fundamentais estudos que contemplem as etapas e a melhor sequência de purificação da enzima de modo a maximizar a pureza do processo sem prejuízos ao rendimento. Dessa forma é importante estabelecer os processos e designs de purificação e recuperação desta enzima. Este trabalho teve como objetivo avaliar a purificação de β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus CCT 7082 através do estudo dos parâmetros de operação do sistema aquoso bifásico (SAB) e ultrafiltração, e estabelecer o melhor design para a purificação da enzima utilizando as técnicas de precipitação com sulfato de amônio, diafiltração, cromatografia de troca iônica, SAB e ultrafiltração. A presente dissertação foi dividida em três artigos. No primeiro artigo, o sistema aquoso bifásico foi estudado realizando uma varredura para seleção da massa molar de polietilenoglicol (PEG) (4000, 6000 e 8000) e o pH do sistema (6,0; 7,0 e 8,0) e posterior utilização da metodologia de superfície de resposta como uma ferramenta para identificar a composição do sistema capaz de maximizar o particionamento e purificação da enzima, avaliando-se a concentração do polímero e fosfato de potássio. Este processo de purificação mostrou-se eficiente, alcançando valores de fator de purificação e recuperação de 3,8 e 101,7%, respectivamente, quando o sistema foi composto por uma concentração de 14% de PEG 4000 e 15% de tampão fosfato de potássio no pH 7,0. O segundo artigo apresenta a concentração e purificação da enzima β-galactosidase por ultrafiltração, onde avaliou-se a influência do pH (6,5; 7,0 e 7,5), massa molar de corte das membranas (30; 50 e 60 kDa), pressão de operação (1,5; 2,0 e 2,5 kgf/cm²) e influência da força iônica (0,01; 0,05 e 0,1 M) na. A utilização da ultrafiltração para concentração e recuperação da enzima mostrou-se satisfatória alcançando valores de até 8,1 vezes e 112,7%, respectivamente. Para a β-galactosidase a ultrafiltração não foi tão eficiente para a purificação, pois alcançou baixos valores de fator de purificação. O aumento da pressão de operação e a adição de cloreto de sódio e potássio ocasionaram prejuízos ao rendimento e a purificação da enzima. O último artigo apresenta o estabelecimento do melhor design para purificação e recuperação da enzima através do uso das técnicas de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica, ultrafiltração, diafiltração e sistema aquoso bifásico em diferentes sequências. O design que apresentou o melhor fator de purificação global foi a sequência formada pelo sistema aquoso bifásico, diafiltração, cromatografia de troca iônica e ultrafiltração, fornecendo um fator de purificação global de 10,8 vezes e uma recuperação global de 41,3%. Dessa forma, foi possível estabelecer um design para purificação da enzima β- galactosidase passível de ampliação de escala (scale up).

The β-galactosidase is an enzyme widely found in the nature, distributed among animals, plants and micro-organisms. It is used industrially for the lactose hydrolysis in milk and dairy products, especially in the preparation of products directed to people with lactose intolerance by enzyme deficiency or absence. Increased demand for industrial β-galactosidase leads to the necessity for production methods that ensure the economic viability of the lactose hydrolysis in commercial scale. Therefore, it is fundamental to find studies that lead to the best sequence of steps and the enzyme purification in order to maximize the process purity without compromising its performance. Thus it is important to establish the design processes considering the purification recovery of this enzyme. This study aimed to evaluate the purification of β- galactosidase from Kluyveromyces marxianus CCT 7082 through the operation parameters study of the aqueous two-phase system (ATPS) and ultrafiltration, and establish the best purification enzyme sequence using the techniques of precipitation with ammonium sulfate, diafiltration, ion exchange chromatography, ultrafiltration and ATPS. This dissertation is divided into three articles. The first article was performed a screening to verify the polymer molecular weight (4000, 6000 and 8000),the system pH (6.0, 7.0 and 8.0) and subsequent use of response surface methodology as a tool to identify the system composition that was able to maximize the enzyme partitioning and purification , by assessing the concentration of polymer and potassium phosphate. This purification process was efficient, reaching recovery and purification factor values of 3.8 and 101.7%, respectively, when the system was composed by a 14% PEG 4000 and 15% potassium phosphate buffer concentration at pH 7.0. The second paper presents the concentration and purification of β-galactosidase enzyme by ultrafiltration where studied the influence of pH (6.5, 7.0 and 7.5), molar mass cutting the membranes (30, 50 and 60 kDa), operating pressure (1.5, 2.0 and 2.5 Kgf/cm²) and the influence of ionic strength (0.01, 0.05 and 0.1 M). The use of ultrafiltration for enzyme concentration and recovery was satisfactory reaching values up to 8.1 fold and 112.7%, respectively. The ultrafiltration was not as effective for purification, since it reached low purification factor values. The operating pressure increase and the sodium chloride and potassium addition caused injury to the enzyme yield and purification. The last paper presents the establishment of the best design for the purification and enzyme recovery through the use of precipitation techniques with ammonium sulfate, ion exchange chromatography, ultrafiltration, diafiltration and aqueous two-phase system in different sequences. The design which showed the best overall purification factor was the sequence formed by aqueous two-phase system, diafiltration, ion exchange chromatography and ultrafiltration, providing an overall purification factor of 10.8 folds and an overall recovery of 41.3%. It was possible to establish designed for β-galactosidase purification with the possibility of the process scale up.