Purificação de C-Ficocianina por diferentes técnicas e avaliação da estabilidade da cor em sorvete

Abstract

A C-ficocianina (C-FC) é uma ficobiliproteína que representa até 20 % da fração proteica de Spirulina, e possui propriedades antioxidantes, hepatoprotetoras, anti-inflamatórias, neuroprotetoras e anticancerígenas. De acordo com a sua pureza, esta proteína pode ser utilizada como corante azul em alimentos e cosméticos, podendo ser aplicada também na indústria de biotecnologia, em diagnósticos e na medicina. Portanto, devido ao seu alto valor agregado e ampla gama de aplicações, é importante ampliar os estudos de técnicas de purificação de C-FC que permitam obter esta proteína com diferentes purezas e elevada recuperação. Dentre estas técnicas, a cromatografia de troca iônica com eluição por gradiente salino é uma das mais utilizadas. No entanto, a eluição por gradiente de pH também se mostra eficiente em purificar esta ficobiliproteína com elevada recuperação, mas é pouco reportada na literatura para este fim. As empresas do ramo alimentício têm procurado remover todos os corantes artificiais de suas linhas de produção, substituindo-os por corantes naturais, devido à preocupação com saúde e segurança alimentar. Assim, são necessários estudos de avaliação da estabilidade da cor dos biocorantes quando em contato com os outros componentes da matriz alimentícia. No que diz respeito às propriedades bioativas, a atividade antioxidante da C-FC isolada já foi investigada por diversos métodos, no entanto, existem poucos relatos na literatura quanto à atividade desta proteína em matrizes alimentares. Neste contexto, esta dissertação foi dividida em três artigos. No primeiro artigo, o objetivo foi purificar a C-ficocianina extraída seletivamente a partir de biomassa úmida de Spirulina platensis LEB-52 por cromatografia de troca iônica com eluição por gradiente de pH. Diferentes parâmetros foram estudados, como o pH de alimentação, a adição de sal no tampão de eluição e o uso de diferentes tampões e volumes de eluição. Os melhores resultados foram obtidos utilizando eluição combinando degrau com 0,08 mol.L-1 de NaCl e gradiente de pH com tampão citrato 0,05 mol.L-1 pH 6,2 - 3,0, resultando em duas frações de C-FC com purezas de 4,2 e 3,5 e recuperações de 32,6 e 49,5%, respectivamente. No segundo artigo, o objetivo foi estudar diferentes designs para purificar a C-FC extraída seletivamente utilizando as técnicas de precipitação fracionada, ultrafiltração e cromatografia de troca iônica, além de avaliar a capacidade antioxidante da C-FC bruta e purificada. O design que resultou em maior pureza com maior recuperação foi o composto por ultrafiltração seguida de cromatografia de troca iônica com eluição por gradiente de pH, pois resultou em C-FC com pureza de 3,9, fator de purificação de 4,9 vezes, e recuperação de 79,7 %. A C-FC purificada apresentou capacidades de sequestro dos radicais ABTS+ (161,66 µmolTE.g-1) e peroxila (1211,41 µmolTE.g-1) significativamente superiores às do extrato bruto. No terceiro artigo, o objetivo foi avaliar a estabilidade da cor ao longo do tempo de sorvetes adicionados de C-FC e a capacidade antioxidante dos produtos após digestão in vitro. Os sorvetes adicionados de C-FC apresentaram cor estável durante 273 d. Além disso, após digestão in vitro, os sorvetes adicionados de C-FC apresentaram atividades antioxidantes de 1362,62 e 134,63 µmolTE.g-1 frente aos radicais ABTS+ e peroxila, respectivamente, sendo estes valores cerca de 13 e 2 vezes superiores aos dos sorvetes controle digeridos. Desta forma, neste estudo foi possível obter C-FC com elevada pureza e recuperação, e, além disso, este biocorante apresentou cor estável em sorvete e bioatividade, demonstrando a potencial aplicação da C-FC como corante natural em substituição aos sintéticos. Palavras-chave: Cromatografia de troca iônica. P

C-phycocyanin (C-PC) is a phycobiliprotein that accounts for up to 20 % of the protein fraction of Spirulina, and presents antioxidant, hepatoprotective, anti-inflammatory, neuroprotective and anticancer properties. Depending on its purity grade, this protein can be used as a blue dye in food and cosmetics, and can also be applied in the biotechnology industry, in diagnostics and in medicine. Thus, due to its high added-value and wide range of applications, it is important to expand the studies of C-PC purification techniques that allow for the obtainment of this protein with different purities and high recovery. Among these techniques, ion exchange chromatography with salt gradient elution is one of the most used. However, pH gradient elution also appears to be efficient in purifying this phycobiliprotein with high recovery, but it is poorly reported in the literature for this purpose. Food companies have sought to remove all artificial dyes from their production lines, replacing them with natural dyes, due to a growing concern for food safety. Therefore, studies are required to evaluate the color stability of the biocolorants when in contact with the other components of the food matrix. Regarding its bioactive properties, the antioxidant activity of the isolated C-PC has already been investigated by several methods, however, there are few reports in the literature regarding the activity of this protein in food matrices. In this context, this dissertation was divided into three articles. In the first article, the aim was to purify C-phycocyanin selectively extracted from the wet biomass of Spirulina platensis LEB-52 by ion gradient chromatography with pH gradient elution. Different parameters were studied, such as loading pH, addition of salt in the elution buffer and the use of different buffers and elution volumes. The best results were obtained using elution combining a step with 0.08 mol.L-1 NaCl and a pH gradient with 0.05 mol.L-1 citrate buffer pH 6.2 - 3.0, resulting in two C-PC fractions with purities of 4.2 and 3.5 and recoveries of 32.6 and 49.5%, respectively. In the second article, the aim was to study different designs to purify the selectively extracted C-PC using fractional precipitation, ultrafiltration and ion exchange chromatography, as well as to evaluate the antioxidant capacity of the crude and purified C-PC. The design that resulted in high purity with high recovery consisted in ultrafiltration followed by ion exchange chromatography with pH gradient elution, resulting in C-PC with purity of 3.9, purification factor of 4.9-fold, and recovery of 79.7 %. The purified C-PC presented significantly higher scavenging capacities for ABTS+ (161.66 molTE.g-1) and peroxyl (1211.41 molTE.g-1) radicals when compared to the crude extract. In the third article, the aim was to evaluate the color stability over time of C-PC-added ice creams and the antioxidant capacity of the products after in vitro digestion. The C-PC-added ice creams presented color stability for 273 d. In addition, after the in vitro digestion, the C-PC-added ice creams presented antioxidant activities of 1362.62 and 134.63 molTE.g-1 against ABTS+ and peroxyl radicals, respectively, and these values were about 13 and 2 times higher than the achieved by the control ice creams after digestion. Therefore, in this study it was possible to obtain C-PC with high purity and recovery, and, moreover, this biocompound presented a stable color in ice cream and bioactivity, demonstrating the application potential of C-PC as a natural dye replacing synthetic colorants.