Purificação de peroxidase por cromatografia de troca iônica em leito expandido integrado à ultrafiltração e sua aplicação na redução dos níveis de deoxinivalenol

Abstract

A peroxidase (CE 1.11.1. X) catalisa a oxidação de uma variedade de substratos orgânicos, tendo o peróxido de hidrogênio ou outros peróxidos orgânicos como moléculas aceptoras. Esta enzima pode ser obtida a partir de vegetais, tecidos e secreções de animais e micro-organismos. Obter esta enzima através de coprodutos da agroindústria possibilita a redução de custos de produção e sua aplicação industrial. O farelo de arroz, um coproduto resultante do beneficiamento do arroz, dispõe de diversas enzimas, as quais incluem as peroxidase, o que o torna uma fonte potencial para obtenção desta. Devido à sua natureza oxidativa, especificidade e atuação em condições moderadas, a peroxidase pode ser aplicada para fins de biorremediação, com destaque para a redução dos níveis de micotoxinas. Estudos na área sugerem que a purificação de peroxidase pode aumentar a sua capacidade de degradar certos substratos, o que torna interessante o estudo de técnicas de purificação possíveis de ampliação de escala, que resultem em maior pureza da enzima e com maior rendimento possível. Assim, este trabalho teve por objetivo purificar a enzima peroxidase de farelo de arroz utilizando cromatografia de troca iônica (CTI) em leito expandido integrado à ultrafiltração (UF), e aplicá-la na redução dos níveis de deoxinivalenol (DON). O trabalho foi dividido em dois artigos, onde o primeiro consistiu em avaliar os principais parâmetros das etapas de adsorção, lavagem e eluição para a purificação de peroxidase por CTI em leito expandido. O uso do tampão acetato de sódio 0,025 mol/L em pH 4,5 e grau de expansão de 2,5 foram as condições definidas para a adsorção de peroxidase em trocador catiônico Streamline SP, apresentando capacidade de adsorção no equilíbrio (q*) de 2,68 U/mL de resina e capacidade dinâmica de adsorção (Q10% ) de 0,19 U/mL de resina. O uso do pH 5,5 na lavagem e a combinação da eluição do tipo degrau em 0,15 mol/L de NaCl e gradiente linear salino de 0,15 a 1 mol/L de NaCl acrescido de CaCl2 0,001 mol/L em tampão acetato de sódio 0,025 mol/L pH 5,5, proporcionaram a purificação da peroxidase em 14,6 vezes com recuperação enzimática de 51,5%. No segundo artigo, foi avaliada a possibilidade de integrar a CTI em leito expandido à UF para purificação de peroxidase, bem como a aplicação da enzima na redução dos níveis de DON em sistema modelo. O uso de membrana de massa molar limite de 10 kDa, temperatura de 10ºC, seis ciclos de diafiltração (DF) e adição de CaCl2 0,004 mol/L à solução dialfiltrante resultou nos valores de fator de purificação e recuperação enzimática de 4,4 vezes e 79,4%, respectivamente. O processo global integrando duas técnicas resultou na purificação da peroxidase em 75,1 vezes e recuperação enzimática de 22,8%. O perfil eletroforético da peroxidase purificada revelou duas possíveis isoenzimas de massa molecular de 35,6 kDa e 65,4 kDa. A aplicação da peroxidase purificada por CTI em leito expandido integrado à UF resultou na redução em 81,7% nos níveis de DON, ainda que utilizando baixa atividade enzimática no meio reacional (0,01 U/mL).

Peroxidases (EC 1.11.1.X) are enzymes whose main function is to catalyze the oxidation of a wide range of organic substrates by either H2O2 or organic peroxides as terminal oxidants. They are widely found in plants, animal tissues and secretions, and microorganisms. Obtaining peroxidases from by-products of agro-industry enables production costs reduction and their industrial application. Rice bran, a by-product of the polishing of rice grain, is a potential source for obtaining peroxidases because it contains various enzymatic systems that use these enzymes. Due to the oxidative nature, substrate specificity and capacity to catalyze in mild conditions, peroxidases are useful for bioremediation applications, especially for reducing mycotoxins levels. Besides that, studies suggest that peroxidase purification can improve certain substrate degradation, which makes interesting to study purification techniques that result in a product with purity and yield as high as possible. Thus, the goal of this work was the purification of peroxidase from rice bran by ion exchange chromatography (IEC) in expanded bed mode integrated to ultrafiltration (UF), and enzyme application in deoxynivalenol (DON) levels reduction. In first article, the main parameters of adsorption, washing and elution steps for peroxidase purification by IEC in expanded bed mode were evaluated. The use of 0.025 mol/L sodium acetate buffer pH 4.5 and expansion degree of 2.5 proved the most suitable conditions for peroxidase adsorption in Streamline SP cation exchanger, showing adsorption capacity in equilibrium (q*) of 2.68 U/mL resin and dynamic binding capacity (Q10%) of 0.18 U/mL resin. The highest process efficiency was observed using pH 5.5 in washing and elution steps, as well as the elution in step-wise mode with 0.15 mol/L NaCl coupled to linear gradient mode from 0.15 to 1 mol/L NaCl increased with 0.001 mo/L CaCl2 in 0.025 mol/L sodium acetate buffer pH 5.5, which resulted in a purification factor of 14.6-fold with enzymatic recovery of 51.5%. In second article, the possibility of integrating IEC in expanded bed mode to UF for peroxidase purification was evaluated, as well as enzyme application in reducing DON levels in model system. The use of molecular mass cut-off membrane of 10 kDa, temperature of 10ºC, six cycles of diafiltration (DF) and adding 0.004 mol/L CaCl2 in DF solution promoted the enzyme purification in 4.4-fold and enzymatic recovery of 79.4%. The global purification process integrating two techniques resulted in the peroxidase purification in 75.1-fold with an enzymatic recovery of 22.8%. Electrophoretic profile of purified peroxidase showed two possible isoenzymes with molecular mass of 36.5 kDa and 65.4 kDa. Purified peroxidase application for IEC in expanded mode integrated to UF resulted in the reduction of 81.7% in DON levels, even using low enzyme activity in reaction system (0.01 U/mL).