Abstract:
A alta quantia de coprodutos residuais queratinosos depositados no meio ambiente desencadeou o desenvolvimento de processos biotecnológicos com enzimas queratinolíticas. O emprego de líquidos iônicos (LI) é apontado como uma nova tecnologia podendo aprimorar a estabilidade de enzimas. No presente trabalho, a queratinase foi tratada em LI para investigar o efeito na estabilidade térmica e atividade catalítica. A enzima foi obtida a partir do gênero Bacillus sp. P45, purificada por sistema aquoso bifásico seguido de ultrafiltração/diafiltração e liofilizada. A termoestabilidade da enzima foi avaliada nos LIs [Mmim][CH3SO4], [TEAA], [Bmim][PF6] e [Emim][Tf2N]. O tratamento da enzima foi realizado sob agitação magnética a 4ºC por 30 min. Adicionalmente foi feito uma comparação da estabilidade enzimática no LI selecionado com os preservativos polietilenoglicol 1500 54% e o uso conjunto de sorbitol 50% e CaCl2 5 mmol.L-1, com tempo de incubação de 15 e 60 min a 55ºC e de 15 min a 70ºC. Na sequência foi determinado os parâmetros cinéticos (meia vida e constante de desnaturação) e as propriedades térmicas por calorimetria diferencial de varredura (DSC) da enzima tratada em [Emim][Tf2N] e forma liofilizada. O efeito na atividade catalítica da enzima tratada foi determinado através do estudo da concentração de [Emim][Tf2N] no meio reacional, da temperatura e pH ótimos tanto no LI como nos preservativos e ainda pela adição dos solventes orgânicos acetona, etanol e isopropanol, nas concentrações de 25 e 50% (v/v) (solvente/enzima tratada no LI). No ensaio contendo o solvente orgânico e LI foi calculado a constante de Michaelis-Menten (KM) e a velocidade máxima (Vmáx). O LI selecionado como melhor estabilizante da queratinase foi o hidrofóbico [Emim][Tf2N], com o melhor efeito em 70ºC, reduzindo 16% da atividade inicial após 15 min, enquanto que tratada em sorbitol+CaCl2 a redução foi de 38%. A meia vida a 70ºC determinada para a enzima tratada em polietilenoglicol 1500, sorbitol+CaCl2 e [Emim][Tf2N] foi de 2,2 min, 28,9 min e 6,4 h, respectivamente, e de 6,4 h para sorbitol+CaCl2 e 3,0 h para polietilenoglicol, a 55ºC. A 55ºC a enzima tratada em LI teve pouca redução na atividade, mantendo 70% da inicial por 32 dias. Na análise de DSC, a enzima foi melhor estabilizada termodinamicamente quando tratada em [Emim][Tf2N], mantendo a sua integridade molecular até a temperatura de 143,2ºC. A concentração de LI adicionado no meio reacional que conduziu a maior atividade foi 4,5% (v/v). A temperatura ótima da enzima tratada no LI [Emim][Tf2N] e em sorbitol+CaCl2 foi de 50 e 60ºC, e pH ótimo igual a 8,0 e 8,5, respectivamente. A enzima tratada em 50% (v/v) do LI e acetona, adicionados ao meio reacional com concentração de LI igual a 2,3% (v/v) aumentou 1,5 vezes o valor da atividade, com KM de 0,94 mg.mL-1 e Vmáx de 25,9 U.mg-1. Portanto, o LI [Emim][Tf2N] foi capaz de estabilizar a queratinase e a adição de acetona permitiu utilizar uma menor quantidade deste LI, obtendo maior atividade.
The high amount of keratin waste byproducts deposited in the environment started the development of biotechnological processes with keratinolytic enzymes. The use of ionic liquids (IL) is considered as a new technology can enhance the stability of enzymes. In this study, the keratinase was treated in IL to investigate the effect on the thermal stability and catalytic activity. The enzyme was obtained from Bacillus sp. P45, purified by aqueous two-phase system followed by ultrafiltration/diafiltration and lyophilized. The thermal stability of the enzyme was evaluated in ionic liquids [Mmim][CH3SO4], [TEAA], [Bmim][PF6] and [Emim][Tf2N]. The enzyme treatment was performed under magnetic stirring at 4ºC for 30 min. A comparison of enzyme stability in IL selected with preservatives polyethylene glycol 1500 54% and joint use sorbitol 50% and CaCl2 5 mmol.L-1 was done, with an incubation time of 15 min and 60 min at 55ºC and 15 min at 70 ºC. Then it was determined kinetic parameters (half life and inactivation rate constant) and thermal properties by differential scanning calorimetry (DSC) of the enzyme treated in [Emim][Tf2N] and preservatives. The effect on the catalytic activity of treated enzyme was determined by studying the [Emim][Tf2N] concentration in reaction medium, temperature and pH optimum in both IL and preservatives, and by the addition of organic solvents acetone, ethanol and isopropanol at concentrations 25% and 50% (v/v) (solvent/enzyme treated in IL). In the assay containing organic solvent and IL it was calculated Michaelis-Menten constant (KM) and the maximal velocity (Vmax). The IL selected as the best keratinase stabilizing was the hydrophobic [Emim][Tf2N], with the best effect at 70ºC, reducing 16% of its initial activity after 15 min, whereas the enzyme treated in sorbitol+CaCl2 was 38%. The half life at 70ºC were determined for the keratinase treated in polyethylene glycol 1500, sorbitol+CaCl2 and [Emim][Tf2N] of 2.2 min, 28.9 min and 6.4 h, respectively, and 6.4 h for sorbitol+CaCl2 and 3 h for polyethylene glycol at 55ºC. At 55ºC the enzyme in IL had little reduction in activity, maintaining 70% of the initial in 32 days. In DSC analysis, the enzyme was stable thermodynamically better when treated in [Emim][Tf2N], maintaining its molecular integrity until the temperature 143.2ºC. The concentration of IL added to the reaction medium which led to highest activity was 4.5% (v/v). The optimum temperature of the enzyme treated in IL and sorbitol+CaCl2 was 50 and 60ºC and the optimum pH was 8.0 and 8.5, respectively. The enzyme treated at 50% (v/v) of IL and acetone added to the reaction medium with IL concentration of 2.3% (v/v) increased 1.5 times the activity value, with KM of 0.94 mg.mL-1 and Vmax of 25.9 U.mg-1. Therefore, [Emim][Tf2N] was able to stabilize the keratinase and with the addition of acetone provided the use of a smaller amount of the IL, obtaining higher activity.
