Produção de celulases a partir de resíduo da indústria arrozeira empregando Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei

Abstract

A produção de enzimas é um campo consolidado da biotecnologia, onde são utilizados processos de fermentação submersa, porém nas últimas décadas vem sendo observada a tendência de utilizar a fermentação em estado sólido para produção de diversas enzimas. As vantagens deste processo são simplicidade de meio de cultura, baixa demanda de energia, diminuindo o custo de produção. Dentre as enzimas utilizadas industrialmente, as celulases tem seu emprego destacado principalmente no Brasil pela aplicação na produção de biocombustíveis. O objetivo do trabalho foi produzir celulase através de fermentação em estado sólido com os micro-organismos GRAS Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, tendo casca e farelo de arroz como substrato. A caracterização físico-química dos substratos foi realizada. As condições de extração enzimática foram estudadas, variando-se o solvente extrator, o tempo e a velocidade de agitação. Para estabelecer condições ótimas de produção enzimática foi estuda a influencia do teor de casca no meio e a umidade inicial no processo fermentativo através de planejamento experimental; o tempo de fermentação, tipo de biorreator e solução nutriente utilizados. As enzimas foram caracterizadas quanto ao pH ótimo, temperatura ótima, estabilidade a temperatura; os parâmetros KM e Vmáx também foram avaliados. Além da produção celulolítica foi avaliada a produção de enzimas amiloliticas e pectinolíticas. A caracterização físico-química dos substratos indicou que a casca de arroz seria um bom indutor da atividade celulolítica, devido ao seu teor de fibras (43,6%). O melhor solvente para extrair o complexo enzimático foi NaCl 0,5% durante 30 min a 25°C sem agitação. Para Rhizopus oryzae as condições ideais para produção celulolítica foram obtidas com 15 h de fermentação em biorreatores de bandeja contendo como substrato 82,5% de casca e 17,5% de farelo de arroz e teor inicial de umidade de 30%, obtendo-se 0,094 e 0,206 U.mgproteína-1, para celulase total e endoglicanase, respectivamente. Para Trichoderma reesei a condição ideal consistia em fermentar em erlenmeyers, contendo somente casca de arroz com umidade inicial de 50%, durante 55 h, obtendo-se 0,110 e 0,605 U.mgproteína-1, para celulase total e endoglicanase, respectivamente. Para ambos os micro-organismos foi utilizada a solução nutriente contendo KH2PO4, (NH4)2SO4, CO(NH2)2, MgSO4.7H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4.H2O, CoCl2, ZnSO4.7H2O. O pH ótimo para atuação da endoglicanase foi de 5,0 e 6,0 e da celulase total 6,0 e 5,0 para Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei, respectivamente. A temperatura ótima das enzimas celulolíticas foi 60 ºC sendo as produzidas por Rhizopus oryzae mais estáveis termicamente que as de Trichoderma reesei. As endoglicanase produzidas por Rhizopus oryzae e Trichoderma reesei apresentaram valores de KM de 0,01 e 0,20 mg/mL, respectivamente.

Enzymes production is a consolidated field within biotechnology, where submerged fermentation process are utilized to this purpose. However, in the last decades, a trend of applying solid state fermentation in order to produce several enzymes has begun. Such procedure advantages are it's culture media simplicity and low energy needs, decreasing production costs. Among enzymes used in industrial facilities, cellulases have its applications highlighted, especially in Brazil, due to biofuels production. This work objective was producing cellulase trough solid state fermentation with the GRAS microorganisms Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei, with rice hull and bran as substrate. Physico-chemical characterization was realized. Enzyme extraction conditions were study by varying the extraction solvent, time and agitation. To establish optimum enzyme production conditions hull percentage in media and initial humidity influences were studied trough experimental design. After the optimization, fermentation time, bioreactor type and nutrient solution effects were evaluated. Enzymes were characterized regarding optimum pH and temperature, thermal stability as well by its Km and Vmax parameters. The amynolitic and pectinolitic enzymes productions were also evaluated. Substrates physico-chemical characterization demonstrated that rice hull would induce well cellulolytic activity due to its high fiber content (43,6%). The solvent that extracted best the enzymatic complex was NaCl 0,5% when applied for 30 minutes at 25°C without agitation. For Rhizopus oryzae the ideal conditions for cellulolytic production were obtained with 15 h fermentation time in tray bioreactors containing 82,5% of rice hull, 17,5% bran and 30% initial humidity , obtaining 0,094 and 0,206 U.mgprotein-1 for total celulase and endoglicanase, respectively. For Trichoderma reesei the best condition consist in fermenting with erlenmeyers containing only rice hull with 50% initial humidity for 55 h, obtaining 0,110 and 0,605 U.mgprotein-1 for total celulase and endoglicanase, respectively. Both microorganisms utilized nutrients solution containing KH2PO4, (NH4)2SO4, CO(NH2)2, MgSO4.7H2O, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4.H2O, CoCl2, ZnSO4.7H2O. Besides cellulolytic activity, amylolitic and pectinolytic production were also evaluated. Optimum pH for endoglicanase activity regarding Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei were, respectively, 5,0 and 6,0 and total cellulolytic enzymes were 6,0 and 5,0. Cellulolytic enzymes optimum temperature was 60°C. The enzymes produced by Rhizopus oryzae were more thermostable than the ones synthesized by Trichoderma reesei. Rhizopus oryzae and Trichoderma reesei endoglicanases presented Km of 0,01 and 0,02 mg.ml-1, respectively.