Abstract:
As lipases e os biossurfactantes são compostos produzidos por microrganismos através de
fermentações em estado sólido (FES) ou sumberso (FSm), os quais são aplicáveis nas
indústrias alimentícia e farmacêutica, na bioenergia e na biorremediação, entre outras. O
objetivo geral deste trabalho foi otimizar a produção de lipases através de fermentação em
estado sólido e fermentação submersa. Os fungos foram selecionados quanto à habilidade
de produção de lipases através de FES e FSm e aqueles que apresentaram as maiores
atividades lipolíticas foram utilizados na seleção de variáveis significativas e na otimização
da produção de lipases nos dois modos de cultivo. Foram empregadas técnicas seqüenciais
de planejamento experimental, incluindo planejamentos fracionários, completos e a
metodologia de superfície de resposta para a otimização da produção de lipases. As
variáveis estudadas na FES foram o pH, o tipo de farelo como fonte de carbono, a fonte de
nitrogênio, o indutor, a concentração da fonte de nitrogênio, a concentração do indutor e a
cepa do fungo. Na FSm, além das variáveis estudadas na FES, estudaram-se as variáveis
concentração inicial de inóculo e agitação. As enzimas produzidas foram caracterizadas
quanto à temperatura e pH ótimos e quanto à estabilidade a temperatura e pH. Nas
condições otimizadas de produção de lipases, foi avaliada a correlação entre a produção de
lipases e bioemulsificantes. Inicialmente foram isolados 28 fungos. Os fungos Aspergillus O-
4 e Aspergillus E-6 foram selecionados como bons produtores de lipases no processo de
fermentação em estado sólido e os fungos Penicillium E-3, Trichoderma E-19 e Aspergillus
O-8 como bons produtores de lipases através da fermentação submersa. As condições
otimizadas para a produção de lipases através de fermentação em estado sólido foram
obtidas utilizando-se o fungo Aspergillus O-4, farelo de soja, 2% de nitrato de sódio, 2% de
azeite de oliva e pHs inferiores a 5, obtendo-se atividades lipolíticas máximas de 57 U. As
condições otimizadas para a produção de lipases na fermentação submersa foram obtidas
utilizando-se o fungo Aspergillus O-8, farelo de trigo, 4,5% de extrato de levedura, 2% de
óleo de soja e pH 7,15. A máxima atividade obtida durante a etapa de otimização foi 6 U. As
lipases obtidas por FES apresentaram atividades máximas a 35ºC e pH 6,0, enquanto que
as obtidas por FSm apresentaram ótimos a 37ºC e pH 7,2. A estabilidade térmica das
lipases produzidas via FSm foi superior a das lipases obtidas via FES, com atividades
residuais de 72% e 26,8% após 1h de exposição a 90ºC e 60ºC, respectivamente. As
lipases obtidas via FES foram mais estáveis em pH´s alcalinos, com atividades residuais
superiores a 60% após 24 h de exposição, enquanto as lipases produzidas via FSm foram
mais estáveis em pH´s ácidos, com 80% de atividade residual na faixa de pH entre 3,5 e 6,5.
Na fermentação submersa a correlação entre a produção de lipases e a atividade emulsificante óleo em água (O/A) e água em óleo (A/O) dos extratos foi 95,4% e 86,8%,
respectivamente, obtendo-se atividades emulsificantes máximas O/A e A/O de 2,95 UE e
42,7 UE. Embora a maior produção de lipases tenha sido obtida na fermentação em estado
sólido, não houve produção concomitante de biossurfactantes. Os extratos da fermentação
submersa apresentaram redução da tensão superficial de 50 mN m
-1
para 28 mN m
-1
e
atividade antimicrobiana frente ao microrganismo S. aureus ATCC 25923, com potenciais
antimicrobianos de 36 a 43% nos três primeiros dias de fermentação. A fermentação
submersa foi a técnica que apresentou os melhores resultados de otimização da produção
de lipases, bem como de produção simultânea de biossurfactantes.
Lipases and biosurfactantes are compounds produced by microrganisms by solid state (SSF)
and submerged fermentations (SmF), being applied in food and pharmaceutical industries, in
bioenergy and bioremediation, between others. The aim of this thesis was to optimize the
production of lipases through solid state and submerged fermentations. The filamentous
fungi were selected by the ability of production of lipases in solid-state and submerged
fermentations and those that presented the highest lipolitic activities were used in the
screening of significant variables and optimization of the lipases production in the both
culture modes. The screening of variables and the optimization of lipase production were
accomplished using sequential techniques of experimental design, including fractionary and
complete designs and the response surface methodology. In solid state fermentation, the
variables pH, bran, nitrogen source, inductor, concentration of the nitrogen source and
inductor, and fungi were studied. In submerged fermentation beyond the variables studied in
SSF, it were studied the initial inoculum concentration and agitation. The enzymes produced
in the optimized conditions were characterized about its optimal temperature and pH and
about its stability in front of temperature and pH. In the optimized conditions of lipase
production, the correlation between lipases and bioemulsifiers production was verified. A
total of 28 fungi were isolated, being selected as good producers of lipases in solid state
fermentation the fungi Aspergillus O-4 and Aspergillus E-6, and as good producers of lipases
in submerged fermentation the strains Penicillium E-3, Trichoderma E-19 and Aspergillus O-
8. In solid state fermentation, optimized conditions of lipase production were obtained using
the fungi Aspergillus O-4, soy bran, 2% of sodium nitrate, 2% of olive oil and pHs varying of
3.5 to 4.5, being obtained maximal lipolitic activities of 57 U. The optimized conditions in
submerged bioprocess were obtained using the fungi Aspergillus (O-8), wheat bran, 4.5% of
yeast extract, 2% of soy oil and pH 7.15, being the maximal activities of 6 U. The optimal
activities of lipases produced in solid-state bioprocess were obtained in pH 6.0 and
temperature of 35°C and for the lipases produced in submerged fermentation at 37ºC and pH
7.2. Lipases produced by SmF were more stable than those produced by FES, with residual
activities of 72% and 26.8% after one hour of exposition at 90ºC and 60ºC, respectively.
Lipases obtained by FES presented higher stability in alcaline pH´s, with residual activities of
60% after 24 h of exposition, while lipases obtained in SmF were more stable in acid pH´s,
with 80% of residual activities in pH´s between 3.5 and 6.5. Lipases obtained in submerged
bioprocess presented maximum activities at 37ºC and pH 7.2, freezing stability at -20ºC
during 90 days, 80% of stability in pH of 3.5 to 6.5 and 50% of stability in pH of 7 to 10. With
respect of temperature stability, the lipases maintained 72% of residual activity intemperatures of 70 to 90ºC, being these good characteristics to industrial applications. In the
submerged bioprocess the correlation of lipase production and the oil/water and water/oil
emulsifier activity of the extracts were 95.4 and 86.8%, respectively, obtaining maximal
emulsifier activities oil/water and water/oil of 2.95 UE and 42.7 UE. In the solid-state
bioprocess, besides the best productivities of lipase production were obtained, no production
of biosurfactants was observed. The extracts of submerged fermentation presented reduction
of superficial tension of 50 to 28 mN m
-1
and antimicrobial activity against the S. aureus
ATCC 25923, with antimicrobial potentials of 36 to 43% until the third days of bioprocess.
The submerged bioprocess presented the best results in the optimization of lipases
production, as well as in the simultaneous production of biosurfactants. Lipases and
biosurfactants produced can be applied in food and pharmaceutical industries or in cases of
bioremediation.
