Abstract:
C-ficocianina (C-FC) é uma ficobiliproteína, de cor natural azul, com diversas aplicações na
indústria alimentícia, farmacêutica e biomédica, dependendo do seu grau específico de pureza,
que pode variar de 0,7 a 4,0, com respectivo aumento de seu valor comercial. Essa pureza é
alcançada através de diversas técnicas de purificação, que podem ser aplicadas em diferentes
sequências. Um destes processos de purificação de proteínas baseia-se na cromatografia de
troca iônica, que utiliza trocadores que adsorvem as proteínas como resultado de interações
iônicas entre a superfície da proteína e o trocador. Resinas e colunas de leito expandido podem
ser utilizadas para aumentar a produtividade dessa técnica. É fundamental conhecer o perfil do
processo de adsorção, para melhor aplicá-lo como ferramenta para o design e otimização de
parâmetros operacionais. Outra tecnologia para o tratamento de biomoléculas é a ultrafiltração.
Esta técnica é aplicável em larga escala, apresenta baixa complexidade de aplicação e pode ser
realizada em condições brandas, minimizando o dano para o produto. Para aumentar a
estabilidade da C-FC, e facilitar a sua aplicação, podem ser avaliadas técnicas recentes, não
exploradas para este fim, como as nanofibras obtidas através do processo de electrospinning.
Estas fibras possuem uma área superficial específica extremamente elevada devido a seu
pequeno diâmetro. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de adsorção e diferentes
técnicas para purificação de C-ficocianina de Spirulina platensis e obter nanofibras poliméricas
incorporadas de C-ficocianina. O trabalho foi dividido em quatro artigos. No primeiro artigo,
foram avaliados os parâmetros e as isotermas de adsorção de C-ficocianina em resina de troca
iônica para leito expandido Streamline® DEAE. Verificou-se que o maior coeficiente de
partição foi obtido em pH 7,5, nas temperaturas de 15 e 25 °C. As isotermas de adsorção da Cficocianina
foram bem representadas pelos modelos de Langmuir, de Freundlich e de
Langmuir-Freundlich, sendo os valores estimados para Qm e Kd obtidos pela isoterma de
Langmuir foram, respectivamente, 33,92 mg.mL-1
e 0,123 mg.mL-1, respectivamente. No
segundo artigo foi avaliada a purificação de C-FC até grau alimentar, utilizando ultrafiltração
(UF). Com a membrana de 50 kDa, identificou-se que somente a temperatura e a aplicação de
diferentes ciclos de diafiltração (DF) causaram influência significativa sobre a purificação e
recuperação da C-ficocianina. Foram então aplicados o aumento gradativo da quantidade de
ciclos, e a diafiltração previamente à ultrafiltração (DF/UF), onde obteve-se um extrato de Cficocianina
com pureza de 0,95. No terceiro artigo foram propostos processos de purificação,
envolvendo a utilização das diferentes técnicas para obtenção de C-FC com diferentes purezas.
Determinou-se que a partir de cromatografia de troca iônica em leito fixo seguido de DF/UF,
obtém-se C-FC para uso em cosméticos e a partir de precipitação com sulfato de amônio, e
DF/UF obtém-se C-FC para uso em biomarcadores. Com uma sequência de precipitação com
sulfato de amônio, DF/UF e cromatografia de troca iônica em leito fixo chega-se a C-FC de
grau analítico. No último artigo, C-FC foi incorporada a nanofibras de óxido de polietileno
(PEO) através de processo de electrospinning. Foram determinadas a condutividade da solução
de C-FC/PEO, a estrutura e comportamento termogravimétrico das nanofibras formadas.
Soluções de polímeros com concentração de 6 e 8% proporcionaram a formação de nanofibras
com diâmetro médio inferior a 800 nm, homogêneas, sem a presença de gotas. A análise
termogravimétrica identificou aumento na resistência térmica da C-FC incorporada nas fibras.
C-phycocyanin is a phycobiliprotein, of a natural blue color, which has several applications in
food, pharmaceutical and biomedical industries. Depending on its specific purity level, which
can vary from 0.7 to 4.0, its commercial value can be increased. This purity is achieved through
various purification techniques, that can be applied in different sequences. One of these
processes, protein purification based on ion exchange chromatography, uses exchangers to
adsorb proteins as a result of ionic interactions between the protein surface and the exchanger.
Expanded bed resins and columns can be utilized to increase the productivity of this technique.
It is essential to determine the profile of the adsorption process, to improve it as a tool for design
and optimization operating parameters. Another technology for biomolecule treatment is
ultrafiltration. This technique is applicable in a large scale, has easy implementation and can be
performed under mild conditions, minimizing damage to product. Among all the forms that
would enable better implementation and greater stability of the C-PC, electrospun nanofibers
have not yet been evaluated. These fibers have an extremely high specific surface area due to
their small diameter. This study aims to evaluate adsorption parameters and different techniques
for purification of C-phycocyanin from Spirulina platensis and produce polymeric nanofibers
containing C-phycocyanin. In the first article, were evaluated the process parameters and Cphycocyanin
adsorption isotherms in ion exchange expanded bed resin Streamline DEAE. It
has been found that the higher partition coefficient occurred at pH 7.5, in 15 and 25 °C. The
adsorption isotherms of C-phycocyanin were found to follow the predictions made by the
Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich models, where the estimated values for Qm and
Kd obtained from Langmuir isotherm were, respectively, 33.92 mg.mL-1
and 0.123 mg.mL-1
. In
the second article, it has been evaluated the C-PC purification to food grade, using ultrafiltration
(UF) technique. With the selected membrane of 50 kDa, it was found that only temperature and
diafiltration cycles (DF) caused significant influence on the purification and recovery of Cphycocyanin.
Thus, the gradual increase of applied cycles, and the diafiltration step were
conducted prior to ultrafiltration (DF/UF), which yielded an extract of C- phycocyanin with
purity around 0.95. In the third article, it has been evaluated different purification processes,
with diverse techniques, to obtain C-PC with different purity levels. It was determined that from
fixed bed ion exchange chromatography, followed by DF/UF, was obtained C-PC for cosmetics
and from precipitation with ammonium sulfate and DF/UF was obtained C-PC for use in
biomarkers. Through sequence precipitation with ammonium sulfate, DF/UF and fixed bed ion
exchange chromatography, was achieved analytical grade C-PC. In the last article, was
produced polyethylene oxide (PEO) nanofibers containing C-PC, through electrospinning
process. It has been determined the conductivity of C-PC/PEO solution, the structure by using
digital optical microscope and thermogravimetric analysis of formed nanofibers. Polymer
solutions with a concentration of 6 to 8% provided the formation of homogeneous nanofibers
with average diameter lower than 800 nm, without beads. Thermogravimetric analysis
identified an increase in the thermal resistance of C-PC incorporated in the fibers
C-ficocianina possui diversas aplicações na indústria alimentícia, farmacêutica e biomédica. Os
fins fitoterápicos apresentados por este produto exigem uma elevada pureza, atingida através
de diversastécnicas de purificação, aplicadas em sequência. Um destes processos de purificação
de proteínas baseia-se em técnicas cromatográficas, tal como a cromatografia de troca iônica,
que utiliza trocadores iônicos que adsorvem as proteínas como resultado de interações iônicas
entre a superfície da proteína e o trocador. Para aumentar a efetividade dessa técnica, pode-se
utilizar resinas e colunas de leito expandido que podem ser utilizadas com volumes maiores de
trabalho. Um estudo detalhado da performance de adsorção é fundamental para um melhor
entendimento do perfil de adsorção e para usar essa informação como uma ferramenta para o
design e otimização de parâmetros operacionais. Neste trabalho, o efeito do pH e da temperatura
sobre a adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline® DEAE para
cromatografia de adsorção em leito expandido foi avaliada através do coeficiente de partição.
Além disso, foram avaliadas as cinéticas e as isotermas de adsorção. Através das cinéticas de
adsorção foi possível observar que o equilíbrio foi atingido após 140 min. O maior coeficiente
de partição foi alcançado em pH de 7,5, nas temperaturas de 15 e 25°C. As isotermas de
adsorção da C-ficocianina foram bem representadas pelo modelo de Langmuir, bem como os
modelos de Freundlich e de Langmuir-Freundlich, onde os valores estimados para Qm e Kd
obtidos pela isoterma de Langmuir foram, respectivamente, 33,92 mg.mL-1
e 0,123 mg.mL-1
.
Com relação a cooperatividade, parâmetro apresentado pelo modelo de Langmuir-Freundlich,
foi considerada como puramente independente para a resina avaliada.
Em todo o mundo, a busca por aditivos naturais tem aumentado. Cianobactérias, como a
Spirulina platensis, podem apresentar uma biomassa rica em pigmentos naturais, como
os carotenóides, as clorofilas e as ficobiliproteínas. Dentre as ficobiliproteínas, destacase
a C-ficocianina que é usada como corante em alimentos e cosméticos. Para estas
aplicações a C-ficocianina precisa apresentar uma pureza igual ou superior a 0,7. A
tecnologia de separação por membranas tem importância no tratamento de biomoléculas
por ser aplicável em larga escala e por apresentar baixa complexidade de aplicação. Além
disso, esta técnica é normalmente realizada à temperatura ambiente, o que minimiza o
dano térmico para o produto. Para melhor utilização desta técnica, é recomendado avaliar
a influência das condições operacionais. Neste trabalho foi avaliada a purificação de
C-ficocianina até grau alimentar, utilizando a técnica de separação por membrana de
ultrafiltração. Foi realizada a seleção da membrana a ser utilizada através de ensaios
comparativos entre uma membrana de retenção nominal de 50 kDa e uma de 100 kDa,
concluindo-se que a de 50 kDa apresentou melhores condições de purificação. Com a
membrana selecionada foi realizado um delineamento experimental fracionário para
identificar qual a influência dos parâmetros pH, temperatura, pressão e aplicação de
diferentes números de ciclos de diafiltração sobre a purificação e recuperação da
C-ficocianina. Através dos resultados obtidos identificou-se que somente a aplicação de
diferentes ciclos de diafiltração causaram influência significativa sobre as características
do extrato final. Para avaliar a influência da aplicação da diafiltração, foram realizados
ensaios aumentando gradativamente a quantidade de ciclos aplicados, onde verificou-se
que a aplicação de 6 ciclos de diafiltração foi o ideal para obter C-ficocianina com maior
pureza (0,91) e menor perda na recuperação. Por último, foi avaliado a aplicação da
diafiltração previamente a etapa de ultrafiltração/concentração, onde verificou-se um
aumento na eficiência da purificação, possibilitando a obtenção de extratos de
C-ficocianina com pureza em torno de 0,95, caracterizando o produto como C-ficocianina
de grau alimentar.
