Purificação de C-ficocianina e sua incorporação em nanofibras

Abstract

C-ficocianina (C-FC) é uma ficobiliproteína, de cor natural azul, com diversas aplicações na indústria alimentícia, farmacêutica e biomédica, dependendo do seu grau específico de pureza, que pode variar de 0,7 a 4,0, com respectivo aumento de seu valor comercial. Essa pureza é alcançada através de diversas técnicas de purificação, que podem ser aplicadas em diferentes sequências. Um destes processos de purificação de proteínas baseia-se na cromatografia de troca iônica, que utiliza trocadores que adsorvem as proteínas como resultado de interações iônicas entre a superfície da proteína e o trocador. Resinas e colunas de leito expandido podem ser utilizadas para aumentar a produtividade dessa técnica. É fundamental conhecer o perfil do processo de adsorção, para melhor aplicá-lo como ferramenta para o design e otimização de parâmetros operacionais. Outra tecnologia para o tratamento de biomoléculas é a ultrafiltração. Esta técnica é aplicável em larga escala, apresenta baixa complexidade de aplicação e pode ser realizada em condições brandas, minimizando o dano para o produto. Para aumentar a estabilidade da C-FC, e facilitar a sua aplicação, podem ser avaliadas técnicas recentes, não exploradas para este fim, como as nanofibras obtidas através do processo de electrospinning. Estas fibras possuem uma área superficial específica extremamente elevada devido a seu pequeno diâmetro. O objetivo deste trabalho foi avaliar parâmetros de adsorção e diferentes técnicas para purificação de C-ficocianina de Spirulina platensis e obter nanofibras poliméricas incorporadas de C-ficocianina. O trabalho foi dividido em quatro artigos. No primeiro artigo, foram avaliados os parâmetros e as isotermas de adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica para leito expandido Streamline® DEAE. Verificou-se que o maior coeficiente de partição foi obtido em pH 7,5, nas temperaturas de 15 e 25 °C. As isotermas de adsorção da Cficocianina foram bem representadas pelos modelos de Langmuir, de Freundlich e de Langmuir-Freundlich, sendo os valores estimados para Qm e Kd obtidos pela isoterma de Langmuir foram, respectivamente, 33,92 mg.mL-1 e 0,123 mg.mL-1, respectivamente. No segundo artigo foi avaliada a purificação de C-FC até grau alimentar, utilizando ultrafiltração (UF). Com a membrana de 50 kDa, identificou-se que somente a temperatura e a aplicação de diferentes ciclos de diafiltração (DF) causaram influência significativa sobre a purificação e recuperação da C-ficocianina. Foram então aplicados o aumento gradativo da quantidade de ciclos, e a diafiltração previamente à ultrafiltração (DF/UF), onde obteve-se um extrato de Cficocianina com pureza de 0,95. No terceiro artigo foram propostos processos de purificação, envolvendo a utilização das diferentes técnicas para obtenção de C-FC com diferentes purezas. Determinou-se que a partir de cromatografia de troca iônica em leito fixo seguido de DF/UF, obtém-se C-FC para uso em cosméticos e a partir de precipitação com sulfato de amônio, e DF/UF obtém-se C-FC para uso em biomarcadores. Com uma sequência de precipitação com sulfato de amônio, DF/UF e cromatografia de troca iônica em leito fixo chega-se a C-FC de grau analítico. No último artigo, C-FC foi incorporada a nanofibras de óxido de polietileno (PEO) através de processo de electrospinning. Foram determinadas a condutividade da solução de C-FC/PEO, a estrutura e comportamento termogravimétrico das nanofibras formadas. Soluções de polímeros com concentração de 6 e 8% proporcionaram a formação de nanofibras com diâmetro médio inferior a 800 nm, homogêneas, sem a presença de gotas. A análise termogravimétrica identificou aumento na resistência térmica da C-FC incorporada nas fibras.

C-phycocyanin is a phycobiliprotein, of a natural blue color, which has several applications in food, pharmaceutical and biomedical industries. Depending on its specific purity level, which can vary from 0.7 to 4.0, its commercial value can be increased. This purity is achieved through various purification techniques, that can be applied in different sequences. One of these processes, protein purification based on ion exchange chromatography, uses exchangers to adsorb proteins as a result of ionic interactions between the protein surface and the exchanger. Expanded bed resins and columns can be utilized to increase the productivity of this technique. It is essential to determine the profile of the adsorption process, to improve it as a tool for design and optimization operating parameters. Another technology for biomolecule treatment is ultrafiltration. This technique is applicable in a large scale, has easy implementation and can be performed under mild conditions, minimizing damage to product. Among all the forms that would enable better implementation and greater stability of the C-PC, electrospun nanofibers have not yet been evaluated. These fibers have an extremely high specific surface area due to their small diameter. This study aims to evaluate adsorption parameters and different techniques for purification of C-phycocyanin from Spirulina platensis and produce polymeric nanofibers containing C-phycocyanin. In the first article, were evaluated the process parameters and Cphycocyanin adsorption isotherms in ion exchange expanded bed resin Streamline DEAE. It has been found that the higher partition coefficient occurred at pH 7.5, in 15 and 25 °C. The adsorption isotherms of C-phycocyanin were found to follow the predictions made by the Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich models, where the estimated values for Qm and Kd obtained from Langmuir isotherm were, respectively, 33.92 mg.mL-1 and 0.123 mg.mL-1 . In the second article, it has been evaluated the C-PC purification to food grade, using ultrafiltration (UF) technique. With the selected membrane of 50 kDa, it was found that only temperature and diafiltration cycles (DF) caused significant influence on the purification and recovery of Cphycocyanin. Thus, the gradual increase of applied cycles, and the diafiltration step were conducted prior to ultrafiltration (DF/UF), which yielded an extract of C- phycocyanin with purity around 0.95. In the third article, it has been evaluated different purification processes, with diverse techniques, to obtain C-PC with different purity levels. It was determined that from fixed bed ion exchange chromatography, followed by DF/UF, was obtained C-PC for cosmetics and from precipitation with ammonium sulfate and DF/UF was obtained C-PC for use in biomarkers. Through sequence precipitation with ammonium sulfate, DF/UF and fixed bed ion exchange chromatography, was achieved analytical grade C-PC. In the last article, was produced polyethylene oxide (PEO) nanofibers containing C-PC, through electrospinning process. It has been determined the conductivity of C-PC/PEO solution, the structure by using digital optical microscope and thermogravimetric analysis of formed nanofibers. Polymer solutions with a concentration of 6 to 8% provided the formation of homogeneous nanofibers with average diameter lower than 800 nm, without beads. Thermogravimetric analysis identified an increase in the thermal resistance of C-PC incorporated in the fibers

C-ficocianina possui diversas aplicações na indústria alimentícia, farmacêutica e biomédica. Os fins fitoterápicos apresentados por este produto exigem uma elevada pureza, atingida através de diversastécnicas de purificação, aplicadas em sequência. Um destes processos de purificação de proteínas baseia-se em técnicas cromatográficas, tal como a cromatografia de troca iônica, que utiliza trocadores iônicos que adsorvem as proteínas como resultado de interações iônicas entre a superfície da proteína e o trocador. Para aumentar a efetividade dessa técnica, pode-se utilizar resinas e colunas de leito expandido que podem ser utilizadas com volumes maiores de trabalho. Um estudo detalhado da performance de adsorção é fundamental para um melhor entendimento do perfil de adsorção e para usar essa informação como uma ferramenta para o design e otimização de parâmetros operacionais. Neste trabalho, o efeito do pH e da temperatura sobre a adsorção de C-ficocianina em resina de troca iônica Streamline® DEAE para cromatografia de adsorção em leito expandido foi avaliada através do coeficiente de partição. Além disso, foram avaliadas as cinéticas e as isotermas de adsorção. Através das cinéticas de adsorção foi possível observar que o equilíbrio foi atingido após 140 min. O maior coeficiente de partição foi alcançado em pH de 7,5, nas temperaturas de 15 e 25°C. As isotermas de adsorção da C-ficocianina foram bem representadas pelo modelo de Langmuir, bem como os modelos de Freundlich e de Langmuir-Freundlich, onde os valores estimados para Qm e Kd obtidos pela isoterma de Langmuir foram, respectivamente, 33,92 mg.mL-1 e 0,123 mg.mL-1 . Com relação a cooperatividade, parâmetro apresentado pelo modelo de Langmuir-Freundlich, foi considerada como puramente independente para a resina avaliada.

Em todo o mundo, a busca por aditivos naturais tem aumentado. Cianobactérias, como a Spirulina platensis, podem apresentar uma biomassa rica em pigmentos naturais, como os carotenóides, as clorofilas e as ficobiliproteínas. Dentre as ficobiliproteínas, destacase a C-ficocianina que é usada como corante em alimentos e cosméticos. Para estas aplicações a C-ficocianina precisa apresentar uma pureza igual ou superior a 0,7. A tecnologia de separação por membranas tem importância no tratamento de biomoléculas por ser aplicável em larga escala e por apresentar baixa complexidade de aplicação. Além disso, esta técnica é normalmente realizada à temperatura ambiente, o que minimiza o dano térmico para o produto. Para melhor utilização desta técnica, é recomendado avaliar a influência das condições operacionais. Neste trabalho foi avaliada a purificação de C-ficocianina até grau alimentar, utilizando a técnica de separação por membrana de ultrafiltração. Foi realizada a seleção da membrana a ser utilizada através de ensaios comparativos entre uma membrana de retenção nominal de 50 kDa e uma de 100 kDa, concluindo-se que a de 50 kDa apresentou melhores condições de purificação. Com a membrana selecionada foi realizado um delineamento experimental fracionário para identificar qual a influência dos parâmetros pH, temperatura, pressão e aplicação de diferentes números de ciclos de diafiltração sobre a purificação e recuperação da C-ficocianina. Através dos resultados obtidos identificou-se que somente a aplicação de diferentes ciclos de diafiltração causaram influência significativa sobre as características do extrato final. Para avaliar a influência da aplicação da diafiltração, foram realizados ensaios aumentando gradativamente a quantidade de ciclos aplicados, onde verificou-se que a aplicação de 6 ciclos de diafiltração foi o ideal para obter C-ficocianina com maior pureza (0,91) e menor perda na recuperação. Por último, foi avaliado a aplicação da diafiltração previamente a etapa de ultrafiltração/concentração, onde verificou-se um aumento na eficiência da purificação, possibilitando a obtenção de extratos de C-ficocianina com pureza em torno de 0,95, caracterizando o produto como C-ficocianina de grau alimentar.