Abstract:
Xilanases são enzimas que catalisam a hidrólise das xilanas e têm sido em grande parte,
obtidas a partir de bolores e bactérias. No entanto poucos estudos têm sido relatados sobre a
produção destas enzimas por leveduras. O presente trabalho teve como objetivo isolar
leveduras de diferentes fontes vegetais visando à produção de xilanases, além de maximizar
sua produção, estudar o uso de diferentes fontes de nitrogênio e cultivar as leveduras em
meios contendo coprodutos agroindustriais. As amostras de alimentos e resíduos foram
enriquecidas em caldo extrato de malte e levedura e isoladas em Ágar Nutriente Wallerstein,
as leveduras isoladas foram, a seguir, avaliadas quanto à capacidade de degradar xilana
presente no meio e produzir halos de hidrólise, os quais foram visualizados através do uso do
corante vermelho congo. Os micro-organismos selecionados como potenciais produtores de
xilanase foram crescidos em meio complexo líquido e as atividades enzimáticas de
endoxilanase, β-xilosidase, carboximetilcelulase, celulase total, pH e concentração de
biomassa foram avaliadas ao longo de 96 h de cultivo. Dentre as leveduras isoladas, sete
foram selecionadas, e a 18Y foi a que apresentou a maior atividade de endo- xilanase
(2,7 U.mL-1
), sendo esta isolada de chicória e identificada como Cryptococcus laurentii. Esta
estirpe apresentou capacidade de produzir xilanase com baixos níveis de celulase, sendo assim
selecionada neste trabalho. A maximização de endo-xilanase foi avaliada fazendo uso de
planejamento experimental onde primeiramente foi realizado um planejamento fracionário
2
6-2
para verificar os efeitos do pH inicial e as concentrações de xilana, peptona, (NH4)2SO4,
extrato de levedura e KH2PO4 sobre a atividade enzimática. Após selecionar as variáveis
xilana, peptona, pH e extrato de levedura foi realizado um delineamento composto central
rotacional (24
) onde todos os cultivos foram mantidos a 30°C, 150 rpm durante 96 h sendo
retiradas alíquotas para determinação das atividades, pH e biomassa. A produção máxima foi
de 6,9 U.mL-1
usando 10,0 g.L-1
de extrato de levedura, 10,0 g.L-1 de peptona, 10,0 g.L-1
de
xilana, 1,0 g.L-1
de (NH4)2SO4 em pH 6,5 o que permitiu um incremento de mais de 250%
sobre a atividade. Posteriormente foram realizados ensaios avaliando diferentes fontes e
concentrações de nitrogênio orgânico e inorgânico. A presença de NH4NO3 e (NH₄)₂SO₄
usados na concentração de 3% proporcionaram as maiores atividades de endo-xilanase (6,2 e
6,0 U.mL-1
respectivamente). O sulfato de amônio foi selecionado e fixado em 1 g.L-1
e logo
após um planejamento completo 22
foi realizado onde as variáveis xilana e extrato de levedura
foram estudadas e as demais fixadas. As condições ótimas estabelecidas para a produção da
enzima foram: concentração de xilana de 18,6 g.L-1
, concentração de extrato de levedura de
10 g.L-1
atingindo 14 U.mL-1
. Após a maximização enzimática estudou-se o crescimento de
Pichia pastoris NRRL Y-1603 e Cryptococcus laurentti em cinco substratos agroindustriais
visando a possibilidade estes substratos substituírem a xilana em cultivos para a produção de
endo-xilanase. Os ensaios foram realizados utilizando os subtratos pré-tratados com NaOH
4% e não tratados. Para inserção dos mesmos aos meios de cultivo, estes foram moídos e
adicionados na concentração de 2%. O pré-tratamento para todos as fontes de hemicelulose
foi eficiente e promoveu aumento nas atividades produzidas. Cryptococcus laurentti
apresentou maior atividade enzimática (8,7 U.mL-1
) em farelo de arroz desengordurado e pré-
tratado enquanto que a levedura Pichia pastoris NRRL Y-1603 apresentou sua melhor
condição para produção de endo-xilanase quando cultivada em meio contendo casca de aveia
e o farelo de arroz pré-tratados, alcançando atividades máximas de 7,6 e 7,5 U.mL-1
.
Xylanases are enzymes which catalyze the hydrolysis of xylan and have been mostly obtained
from fungi and bacteria. However, few studies have been reported about production of these
enzymes by yeasts. This study aimed to isolate yeasts from different plant sources for
xylanase production, besides of maximizes its production, to evaluate use of different of
nitrogen sources and rear yeast in agro-industrial byproducts. Samples of food and wastes
were enriched in a sort of malt extract and yeast and isolated on Nutrient Agar Wallerstein.
Afterwards the isolated yeast was evaluated for capacity of to degrade xylan and of producing
halos of hydrolysis which were visualized using congo red dye. The microorganisms selected
as potential xylanase producers were grown in complex liquid source and the enzymatic
activity of endo-xylanase, β-xylosidase, carboxymethylcellulase, FPase, pH and concentration
of biomass were evaluated after 96 hours. Among all isolated yeasts, seven were selected, and
the 18Y showed the most endo- xylanase activity (2.7 U.mL-1), which was isolated from
chicory and identified as Cryptococcus laurentii. This strain was able to produce xylanase
with low levels of cellulase, and thus is selected in this work. The maximization of endoxylanase
was evaluated by experimental design which was first performed in a factorial
desing of 26-2 in order of to verify effects on initial pH and concentrations of xylan, peptone,
(NH42SO4,yeast extract and KH2PO4 on the enzymatic activity. After the xylan, peptone, pH
and yeast extract variables were selected an central composite desing (24
) was performed
where all rearings were maintained at 30 °C, 150 rpm during 96 h and samples were taken for
determination of activity, pH and biomass. The highest production was 6.9 U.mL-1
using 10.0
g L-1
of yeast extract, 10.0 g L-1
of peptone, 10.0 gL-1
of xylan and 1.0 gL-1
of (NH4)2SO4 at
pH 6.5 which increased the activity over 250%. Afterwards tests evaluating different sources
of both organic and inorganic nitrogen concentrations were conducted. The presence of
NH4NO3 and (NH₄)₂SO₄ used in a concentration of 3% showed the highest endo-xylanase
activity (6.2 and 6.0 U.mL-1
respectively). Ammonium sulfate was selected and established at
1 g.L-1
and after a central composite desing 2
2 was run where xylan and yeast extract variables
were studied and the other ones set. The optimum conditions for enzyme production were
established as: xylan concentration of 18.6 g L-1
, yeast extract concentration of 10 g L-1
reaching 14 U.mL-1
. After enzyme maximization the growth of Pichia pastoris NRRL Y-1603
and Cryptococcus laurentti were evaluated in five agroindustrial sources aiming that these
substrates might replace xylan for the production of endo-xylanase. Experiments were
performed using substrates pre-treated with 4% NaOH and untreated. In order to insert the
same conditions, these were ground and added at a concentration of 2%. The pre-treatment for
all sources of hemicellulose was efficient and promoted an increase in the activities.
Cryptococcus laurentti showed higher enzyme activity (8.7 U.mL-1) in pre-treated defatted
rice bran while the yeast of Pichia pastoris NRRL Y-1603 showed its best condition for endoxylanase
production when grown in oat hulls and pre-treated rice bran source, reaching top
activities of 7.6 and 7.5 U.mL-1
.
Xilanases são enzimas que catalisam a hidrólise das xilanas, e têm sido em grande parte,
obtidas a partir de bolores e bactérias, sendo que na literatura existem poucos estudos sobre a
produção destas enzimas por leveduras. O presente estudo teve como objetivo isolar leveduras
de diferentes fontes, tais como vegetais, grãos de cereais, frutas e resíduos agroindustriais
com capacidade de produzir enzimas xilanolíticas. As amostras foram enriquecidas em Caldo
Extrato de Malte e Levedura e isoladas em Agar Nutriente Wallerstein. As leveduras foram
avaliadas em termos da sua capacidade para degradar xilana através da capacidade das
mesmas degradarem o polissacarídeo do meio e produzir halos de hidrólise, os quais foram
visualizados através do uso do corante vermelho congo e lavados com diferentes
concentrações de soluções salinas. Os micro-organismos selecionados foram crescidos em
meio complexo líquido e as atividades enzimáticas de endoxilanase, β-xilosidase,
carboximetilcelulase, celulase total, pH e concentração de biomassa foram avaliados ao longo
de 96 h de cultivo. Dentre as leveduras estudadas, sete foram selecionadas, e a levedura 18Y
foi a que apresentou a maior atividade de endo-xilanase (2,7 U.mL-1
), sendo esta isolada a
partir de chicória e identificada como Cryptococcus laurentii. Esta levedura apresentou
capacidade de produzir xilanase com baixos níveis de celulase, um fator que lhe concede
grande potencial uma vez que esta enzima pode ser usada, além das aplicações em alimentos,
também para branqueamento industrial e polpa de papel .
A produção de endo-xilanase de Cryptococcus laurentti em cultivos sumersos foi avaliada
fazendo uso da ferramenta planejamento experimental. Primeiramente foi realizado um
planejamento fracionário 26-2
para verificar os efeitos do pH inicial e as concentrações de
xilana, peptona, (NH4)2SO4, extrato de levedura e KH2PO4 sobre a atividade enzimática. Após
selecionar as variáveis xilana, peptona, pH e extrato de levedura foi realizado um
delineamento composto central rotacional (24 com pontos centrais e axiais) totalizando 28
ensaios e tendo como resposta a atividade de endo-xilanase. Todos os cultivos foram
mantidos a 30 °C, 150 rpm durante 96 h onde alíquotas para determinação de atividade, pH e
biomassa foram retiradas. Foi verificada também a influência da agitação dos cultivos
avaliando três agitações diferentes: 150, 175 e 200 rpm. A produção inicial máxima de endoxilanase
da levedura Cryptococcus laurentii foi de 2,7 U.mL-1
, a qual, após o estudo dos
componentes e pH do meio de cultivo, teve um incremento de 170%, onde a atividade
máxima foi de 6,9 U.mL-1
usando 10,0 g.L-1
de extrato de levedura, 10,0 g.L-1 de peptona,
10,0 g.L-1
de xilana, 1,0 g.L-1
de (NH4)2SO4 em pH 6,5 e agitação de 150 rpm. Assim,
aumentando a velocidade de agitação para 175 rpm, a atividade enzimática produzida foi de
7,3 U.mL-1
. Dessa forma foi possível aumentar significativamente a atividade de endoxilanase
produzida pele levedura isolada.
