Isolamento, seleção e cultivo de leveduras com potencia biotecnológico para a produção de endo-xilaneses

Abstract

Xilanases são enzimas que catalisam a hidrólise das xilanas e têm sido em grande parte, obtidas a partir de bolores e bactérias. No entanto poucos estudos têm sido relatados sobre a produção destas enzimas por leveduras. O presente trabalho teve como objetivo isolar leveduras de diferentes fontes vegetais visando à produção de xilanases, além de maximizar sua produção, estudar o uso de diferentes fontes de nitrogênio e cultivar as leveduras em meios contendo coprodutos agroindustriais. As amostras de alimentos e resíduos foram enriquecidas em caldo extrato de malte e levedura e isoladas em Ágar Nutriente Wallerstein, as leveduras isoladas foram, a seguir, avaliadas quanto à capacidade de degradar xilana presente no meio e produzir halos de hidrólise, os quais foram visualizados através do uso do corante vermelho congo. Os micro-organismos selecionados como potenciais produtores de xilanase foram crescidos em meio complexo líquido e as atividades enzimáticas de endoxilanase, β-xilosidase, carboximetilcelulase, celulase total, pH e concentração de biomassa foram avaliadas ao longo de 96 h de cultivo. Dentre as leveduras isoladas, sete foram selecionadas, e a 18Y foi a que apresentou a maior atividade de endo- xilanase (2,7 U.mL-1 ), sendo esta isolada de chicória e identificada como Cryptococcus laurentii. Esta estirpe apresentou capacidade de produzir xilanase com baixos níveis de celulase, sendo assim selecionada neste trabalho. A maximização de endo-xilanase foi avaliada fazendo uso de planejamento experimental onde primeiramente foi realizado um planejamento fracionário 2 6-2 para verificar os efeitos do pH inicial e as concentrações de xilana, peptona, (NH4)2SO4, extrato de levedura e KH2PO4 sobre a atividade enzimática. Após selecionar as variáveis xilana, peptona, pH e extrato de levedura foi realizado um delineamento composto central rotacional (24 ) onde todos os cultivos foram mantidos a 30°C, 150 rpm durante 96 h sendo retiradas alíquotas para determinação das atividades, pH e biomassa. A produção máxima foi de 6,9 U.mL-1 usando 10,0 g.L-1 de extrato de levedura, 10,0 g.L-1 de peptona, 10,0 g.L-1 de xilana, 1,0 g.L-1 de (NH4)2SO4 em pH 6,5 o que permitiu um incremento de mais de 250% sobre a atividade. Posteriormente foram realizados ensaios avaliando diferentes fontes e concentrações de nitrogênio orgânico e inorgânico. A presença de NH4NO3 e (NH₄)₂SO₄ usados na concentração de 3% proporcionaram as maiores atividades de endo-xilanase (6,2 e 6,0 U.mL-1 respectivamente). O sulfato de amônio foi selecionado e fixado em 1 g.L-1 e logo após um planejamento completo 22 foi realizado onde as variáveis xilana e extrato de levedura foram estudadas e as demais fixadas. As condições ótimas estabelecidas para a produção da enzima foram: concentração de xilana de 18,6 g.L-1 , concentração de extrato de levedura de 10 g.L-1 atingindo 14 U.mL-1 . Após a maximização enzimática estudou-se o crescimento de Pichia pastoris NRRL Y-1603 e Cryptococcus laurentti em cinco substratos agroindustriais visando a possibilidade estes substratos substituírem a xilana em cultivos para a produção de endo-xilanase. Os ensaios foram realizados utilizando os subtratos pré-tratados com NaOH 4% e não tratados. Para inserção dos mesmos aos meios de cultivo, estes foram moídos e adicionados na concentração de 2%. O pré-tratamento para todos as fontes de hemicelulose foi eficiente e promoveu aumento nas atividades produzidas. Cryptococcus laurentti apresentou maior atividade enzimática (8,7 U.mL-1 ) em farelo de arroz desengordurado e pré- tratado enquanto que a levedura Pichia pastoris NRRL Y-1603 apresentou sua melhor condição para produção de endo-xilanase quando cultivada em meio contendo casca de aveia e o farelo de arroz pré-tratados, alcançando atividades máximas de 7,6 e 7,5 U.mL-1 .

Xylanases are enzymes which catalyze the hydrolysis of xylan and have been mostly obtained from fungi and bacteria. However, few studies have been reported about production of these enzymes by yeasts. This study aimed to isolate yeasts from different plant sources for xylanase production, besides of maximizes its production, to evaluate use of different of nitrogen sources and rear yeast in agro-industrial byproducts. Samples of food and wastes were enriched in a sort of malt extract and yeast and isolated on Nutrient Agar Wallerstein. Afterwards the isolated yeast was evaluated for capacity of to degrade xylan and of producing halos of hydrolysis which were visualized using congo red dye. The microorganisms selected as potential xylanase producers were grown in complex liquid source and the enzymatic activity of endo-xylanase, β-xylosidase, carboxymethylcellulase, FPase, pH and concentration of biomass were evaluated after 96 hours. Among all isolated yeasts, seven were selected, and the 18Y showed the most endo- xylanase activity (2.7 U.mL-1), which was isolated from chicory and identified as Cryptococcus laurentii. This strain was able to produce xylanase with low levels of cellulase, and thus is selected in this work. The maximization of endoxylanase was evaluated by experimental design which was first performed in a factorial desing of 26-2 in order of to verify effects on initial pH and concentrations of xylan, peptone, (NH42SO4,yeast extract and KH2PO4 on the enzymatic activity. After the xylan, peptone, pH and yeast extract variables were selected an central composite desing (24 ) was performed where all rearings were maintained at 30 °C, 150 rpm during 96 h and samples were taken for determination of activity, pH and biomass. The highest production was 6.9 U.mL-1 using 10.0 g L-1 of yeast extract, 10.0 g L-1 of peptone, 10.0 gL-1 of xylan and 1.0 gL-1 of (NH4)2SO4 at pH 6.5 which increased the activity over 250%. Afterwards tests evaluating different sources of both organic and inorganic nitrogen concentrations were conducted. The presence of NH4NO3 and (NH₄)₂SO₄ used in a concentration of 3% showed the highest endo-xylanase activity (6.2 and 6.0 U.mL-1 respectively). Ammonium sulfate was selected and established at 1 g.L-1 and after a central composite desing 2 2 was run where xylan and yeast extract variables were studied and the other ones set. The optimum conditions for enzyme production were established as: xylan concentration of 18.6 g L-1 , yeast extract concentration of 10 g L-1 reaching 14 U.mL-1 . After enzyme maximization the growth of Pichia pastoris NRRL Y-1603 and Cryptococcus laurentti were evaluated in five agroindustrial sources aiming that these substrates might replace xylan for the production of endo-xylanase. Experiments were performed using substrates pre-treated with 4% NaOH and untreated. In order to insert the same conditions, these were ground and added at a concentration of 2%. The pre-treatment for all sources of hemicellulose was efficient and promoted an increase in the activities. Cryptococcus laurentti showed higher enzyme activity (8.7 U.mL-1) in pre-treated defatted rice bran while the yeast of Pichia pastoris NRRL Y-1603 showed its best condition for endoxylanase production when grown in oat hulls and pre-treated rice bran source, reaching top activities of 7.6 and 7.5 U.mL-1 .

Xilanases são enzimas que catalisam a hidrólise das xilanas, e têm sido em grande parte, obtidas a partir de bolores e bactérias, sendo que na literatura existem poucos estudos sobre a produção destas enzimas por leveduras. O presente estudo teve como objetivo isolar leveduras de diferentes fontes, tais como vegetais, grãos de cereais, frutas e resíduos agroindustriais com capacidade de produzir enzimas xilanolíticas. As amostras foram enriquecidas em Caldo Extrato de Malte e Levedura e isoladas em Agar Nutriente Wallerstein. As leveduras foram avaliadas em termos da sua capacidade para degradar xilana através da capacidade das mesmas degradarem o polissacarídeo do meio e produzir halos de hidrólise, os quais foram visualizados através do uso do corante vermelho congo e lavados com diferentes concentrações de soluções salinas. Os micro-organismos selecionados foram crescidos em meio complexo líquido e as atividades enzimáticas de endoxilanase, β-xilosidase, carboximetilcelulase, celulase total, pH e concentração de biomassa foram avaliados ao longo de 96 h de cultivo. Dentre as leveduras estudadas, sete foram selecionadas, e a levedura 18Y foi a que apresentou a maior atividade de endo-xilanase (2,7 U.mL-1 ), sendo esta isolada a partir de chicória e identificada como Cryptococcus laurentii. Esta levedura apresentou capacidade de produzir xilanase com baixos níveis de celulase, um fator que lhe concede grande potencial uma vez que esta enzima pode ser usada, além das aplicações em alimentos, também para branqueamento industrial e polpa de papel .

A produção de endo-xilanase de Cryptococcus laurentti em cultivos sumersos foi avaliada fazendo uso da ferramenta planejamento experimental. Primeiramente foi realizado um planejamento fracionário 26-2 para verificar os efeitos do pH inicial e as concentrações de xilana, peptona, (NH4)2SO4, extrato de levedura e KH2PO4 sobre a atividade enzimática. Após selecionar as variáveis xilana, peptona, pH e extrato de levedura foi realizado um delineamento composto central rotacional (24 com pontos centrais e axiais) totalizando 28 ensaios e tendo como resposta a atividade de endo-xilanase. Todos os cultivos foram mantidos a 30 °C, 150 rpm durante 96 h onde alíquotas para determinação de atividade, pH e biomassa foram retiradas. Foi verificada também a influência da agitação dos cultivos avaliando três agitações diferentes: 150, 175 e 200 rpm. A produção inicial máxima de endoxilanase da levedura Cryptococcus laurentii foi de 2,7 U.mL-1 , a qual, após o estudo dos componentes e pH do meio de cultivo, teve um incremento de 170%, onde a atividade máxima foi de 6,9 U.mL-1 usando 10,0 g.L-1 de extrato de levedura, 10,0 g.L-1 de peptona, 10,0 g.L-1 de xilana, 1,0 g.L-1 de (NH4)2SO4 em pH 6,5 e agitação de 150 rpm. Assim, aumentando a velocidade de agitação para 175 rpm, a atividade enzimática produzida foi de 7,3 U.mL-1 . Dessa forma foi possível aumentar significativamente a atividade de endoxilanase produzida pele levedura isolada.