Abstract:
As proteases constituem 60-65% do mercado global das enzimas industriais e são utilizadas
na indústria de alimentos no processo de amaciamento de carne, na síntese de peptídeos,
preparo de fórmulas infantis, panificação, cervejarias, produtos farmacêuticos, diagnósticos
médicos, como aditivos na indústria de detergentes e na indústria têxtil no processo de
depilação e transformação do couro. Proteases específicas produzidas por micro-organismos
queratinolíticos são chamadas de queratinases e distinguem-se de outras proteases pela maior
capacidade de degradação de substratos compactos e insolúveis como a queratina.
Atualmente, processos que apontem o uso total das matérias-primas e que não resultem em
impactos negativos ao meio ambiente tem ganhado destaque. Dentro desta temática,
destacam-se a reutilização da farinha de penas residual durante o cultivo do Bacillus sp. P45
para produção de proteases e a biomassa residual de levedura, ambas com elevados teores de
proteínas, podendo ser utilizadas no cultivo do Bacillus sp. P45 para obtenção de proteases. O
objetivo deste trabalho foi obter a enzima queratinase purificada em grandes quantidades, sua
caracterização, bem como a sua aplicação em processos de coagulação enzimática do leite
para o desenvolvimento de um queijo cremoso enriquecido com farinha de chia e quinoa.
Além disso, aplicar diferentes coprodutos para produção de enzimas proteolíticas e
queratinolíticas. A presente tese foi dividida em quatro artigos: no primeiro foi realizado a
obtenção da queratinase purificada em maiores quantidades e a determinação dos parâmetros
de estabilidade térmica e a influência de componentes químicos na atividade enzimática. A
obtenção da enzima em maiores quantidades alcançou fatores de purificação de 2,6, 6,7 e 4,0
vezes, paras 1º SAB, 2º SAB e diafiltração, respectivamente. A recuperação enzimática
alcançou valores de 75,3% para o 1º SAB, 75,1% no 2º sistema e 84,3% na diafiltração. A
temperatura de 55ºC e o pH 7,5 foram determinados como ótimos para atividade da enzima
queratinase. O valor da energia de desativação (Ed) médio foi de 118,0 kJ/mol e os valores de
z e D variaram de 13,6 a 18,8ºC, e 6,9 a 237,3 min, respectivamente. Além disso a adição de
sais (CaCl2, CaO, C8H5KO4 e MgSO4) elevou a atividade da enzima na presença destes
compostos. O segundo artigo apresenta a aplicação da queratinase como coagulante de leite
bovino e sua aplicação na obtenção de queijo cremoso enriquecido com chia e quinoa. A
enzima mostrou atividade de coagulação semelhante ao coagulante comercial, na
concentração de 30mg/mL. A enzima purificada foi empregada de forma eficiente na
fabricação do queijo cremoso, que apresentou valores de pH de 5,3 e acidez de 0,06 a 0,1
mol/L, com elevação durante os 25 dias de armazenamento. O terceiro artigo apresenta o
perfil do queijo cremoso enriquecido com farinha de chia e quinoa, o qual apresentou alto
índice de retenção de água (>99,0%) e baixos valores de sinérese (<0,72%). Elevados teores
de fibras foi verificado (3,0 a 5,0%), sugerindo seu consumo como fonte de fibras. As análises
microbiológicas foram de acordo com a legislação vigente. Na análise sensorial foi verificado
altos valores de suavidade ao paladar e verificado maiores valores de consistência e
untabilidade nas amostras com maiores concentrações de nata e quinoa. O quarto artigo traz a
extração de β-galactosidase por ultrassom e o uso da biomassa residual da levedura, bem
como o uso de farinha de penas residuais como substrato para obtenção de proteases. O
ultrassom foi eficiente para ruptura celular e extração de β-galactosidase, apresentando alta
atividade (35,0 U/mL) e rendimento (876,0 U/g de biomassa). A maior atividade proteolítica
(1300 U/mL em 32 h) e queratinolítica (89,2 U/mL) verificadas ocorreram utilizando-se a
biomassa e a farinha de penas residuais, respectivamente. Maior produtividade proteolítica
(40,8 U/mL/h) foi verificado no meio utilizando biomassa residual como substrato. Já a maior
produtividade queratinolítica (2,8 U/mL/h) foi alcançada utilizando farinha de penas
reutilizada.
Proteases constitute 60-65% of the global market for industrial enzymes, and most of them are
alkaline proteases used in the food industry in meat tenderizing process, in peptide synthesis,
preparation of infant formula, baking and brewing. Furthermore, they are used in
pharmaceutical industry, medical diagnostics, as additives in laundry detergents and textile
industry in the process of waxing and processing of leather. The specific proteases produced
by keratinolytic microorganisms are denominated keratinases and distinguished from the
other proteases due to their higher capacity to degrade compact and insoluble substrate such
as keratin. Currently, processes that converge to the total use of raw materials and do not
result in negative impacts on the environment has great importance. Within this theme, we
highlight the feather meal; solid residue generated from the Bacillus sp. cultivation P45 for
the production of proteases and the biomass resulting of the bioprocess for obtaining β-
galactosidase by the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7982, which is used for conversion
of lactose into glucose and galactose. After the extraction step, the enzyme is intended for its
application and the residual biomass with a high protein content should be used in cultivation
of Bacillus sp. P45 to keratinase obtainment. The objective of this work was the production of
enzyme keratinase from byproducts, purification and characterization, as well as its
application in enzymatic milk clotting processes for the development of dairy products. This
thesis was divided into four articles: on the first one, the keratinase purification was
performed using systems of larger capacity and in addition, the enzyme was characterized in
terms of optimum pH and temperature, kinetic parameters of denaturation and the influence of
salts and organic solvents over the enzymatic activity. The use of systems with larger
purification capacities allowed the obtainment of the purified enzyme in larger quantities
without compromising purity and recovery. The optimum temperature and pH for enzyme
activity observed was 55º C and 7.5, respectively. The enzyme showed a reduction of half-life
(t1/2) with increased along with the incubation temperature and constant thermal denaturation
was inversely proportional to t1/2. Furthermore, the salts CaCl2, CaO, and C8H5KO4 and
MgSO4 led to higher enzyme activity. The second article presents the keratinase as an
alternative coagulant bovine milk and its application in developing a cream cheese enriched
with chia and quinoa. The clotting enzyme showed similar activity to the commercial
coagulant at a concentration of 30 mg/mL, being capable of hydrolysing casein present in the
milk. The new coagulant was used efficiently in the development of dairy product enriched
with chia and quinoa, functional components. The third article presents the evaluation of
technological, physical, chemical and microbiological characteristics of the cream cheese
enriched with chia and quinoa, which presented high water retention rate and low syneresis
values. The high fiber content suggests that the product can be consumed as a source of fibers
with health benefits. Microbiological and technological analysis showed that the cheese is
stable and innovative, meeting the market's expectations for this type of product. The fourth
article brings the extraction of β-galactosidase by ultrasound and the use of yeast biomass
waste, as well as the use of flour waste feathers as a substrate for obtaining proteases. The
ultrasound was efficient for cell disruption and extraction β-galactosidase, with high activity
(35.0 U/ml) and yield (876.0 U/g of biomass). The major proteolytic activity (1300 U/ml for
32 h) and keratinase (89.2 U/ml) were verified using flour biomass and waste feathers,
respectively.
